1樓：力翠荷
一 免疫組化（sp法）操作步驟
1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行
2.緩衝液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 hydrogen peroxide block 中孵育 10-15 分鐘。
4. 緩衝液洗 5min/2 次。
5. 滴加 ultra v block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。
（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩衝液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）
8. 緩衝液洗 5min/2 次。
9 ． 滴加 primary antibody enhancer（增強子），在室溫下孵育 20 分鐘。
10 ．緩衝液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 hrp polymer（酶標二抗） ，在室溫下孵育 30 分鐘。
（注：hrp polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）
12 ．緩衝液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml dab plus substrate （或 aec plus substrate) 中滴加 1-2 滴 dab plus chromogen （或 aec plus chromogen），混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）
14 ．自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。 ⑴、石蠟切片脫蠟至水。
⑵、 3%h 2 o2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。
⑶、蒸餾水沖洗， pbs 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。
⑷、 5-10% 正常山羊血清（pbs 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。
⑸、 pbs 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
⑹、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
⑺、 pbs 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
⑻、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈黴卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
⑼、 pbs 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
⑽、顯色劑顯色 3-15 分鐘（dab 或 nbt/bcip）
⑾、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。 冰凍切片 4-8μm ，室溫放置 30 分鐘後，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，pbs洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。
2樓：吹西麥格瑞迪
1. 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行
2.緩衝液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 hydrogen peroxide block 中孵育 10-15 分鐘。
4. 緩衝液洗 5min/2 次。
5. 滴加 ultra v block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。
(注:孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 - 10% 正常羊血清，這一步可以省略。)
6. 緩衝液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小時。(具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定)
8. 緩衝液洗 5min/2 次。
9 . 滴加 primary antibody enhancer(增強子)，在室溫下孵育 20 分鐘。
10 .緩衝液洗 5min/2 次。
11 .滴加 hrp polymer(酶標二抗) ，在室溫下孵育 30 分鐘。
(注:hrp polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。)
12 .緩衝液洗 5min/2 次。
13 .向 1ml dab plus substrate (或 aec plus substrate) 中滴加 1-2 滴 dab plus chromogen (或 aec plus chromogen)，混勻後滴加到切片上，孵育 3 - 15 分鐘。(具體時間由染色深淺決定。
)14 .自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。
簡介：免疫組化，是應用免疫學基本原理--抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及相對定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。
基本原理：
抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性，免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物後獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。由於抗原與抗體的複合物是無色的，因此還必須藉助於組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。
3樓：匿名使用者
一 免疫組化（ lp 法）操作步驟 ：
1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行
2. 緩衝液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 hydrogen peroxide block 中孵育 10-15 分鐘。
4. 緩衝液洗 5min/2 次。
5. 滴加 ultra v block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。
（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩衝液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）
8. 緩衝液洗 5min/2 次。
9 ． 滴加 primary antibody enhancer( 增強子 ) , 在室溫下孵育 20 分鐘。
10 ．緩衝液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 hrp polymer( 酶標二抗 ) ，在室溫下孵育 30 分鐘。
（注： hrp polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）
12 ．緩衝液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml dab plus substrate ( 或 aec plus substrate) 中滴加 1-2 滴 dab plus chromogen （或 aec plus chromogen ） , 混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）
14 ．自來水充分沖洗 , 復染，脫水 , 透明 , 封片。
二．免疫組化 ( 三步法 ) 操作步驟 ：
（ 1 ）、石蠟切片脫蠟至水。
（ 2 ）、 3%h 2 o 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸餾水沖洗， pbs 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。
（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ pbs 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。
（ 5 ）、 pbs 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 6 ）、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 7 ）、 pbs 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 8 ）、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈黴卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 9 ）、 pbs 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 10 ）、顯色劑顯色 3-15 分鐘（ dab 或 nbt/bcip ）
（ 11 ）、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。
三. 冰凍切片免疫組化染色步驟：
冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘後，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，pbs洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。以下同石蠟切片免疫組化
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