1樓:匿名使用者
參照此方法,不會錯
2樓:biowit吳
測酶活性的實驗:
.用萃取化學公司法(amano法的改進型)測定葡萄糖氧化酶
(1)試劑
① 磷酸鹽緩衝液(ph7.0):取6.
805g磷酸二氫鉀(kh2po4; merck, art.4873)溶於350ml蒸餾水中。用1m氫氧化鈉溶液(naoh (4g溶於100ml水))將ph值調至7.
0,用蒸餾水定容至500ml。
② 鄰-聯二茴香胺(o-dianisidine)溶液:取1.7mg鄰-聯二茴香胺(c14h16n2o2; serva, nr,19175)溶於25ml磷酸鹽緩衝液。
③ 過氧化物酶(辣根過氧化酶,181u/mg)溶液(約0℃):取1.7mg過氧化物酶(serva, nr,31943)溶於5ml蒸餾水。
每毫公升此溶液中應含有60個紅紫倍精單位。
④ 底物溶液(約0.55m):取5.0gβ-d-葡萄糖(c6h12o6; sigma, no.g-5250)溶於蒸餾水中,定容至50ml。
使用前,至少得將此酶靜置3h。
⑤ 酶(待測的葡萄糖氧化酶)溶液:用磷酸鹽緩衝液溶解該酶。1ml配製的酶溶液中應含有大約0.1u。
0.0037g溶於500μl pbs, 再取10μl前者溶液定容至100pbs(約0.1u/ml)。
測酶活性(118u/mg)的實驗2
(1)操作步驟:將0.50mlβ-d-葡萄糖溶液、0.
10ml在冰水中冷卻過的過氧化物酶(辣根過氧化酶)溶液和2.4ml鄰-聯二茴香胺溶液滴入乙隻小燒杯內混合,調溫至25℃,然後將其全部加到1cm的比色皿內,最後加0.1ml酶於待測的葡萄糖氧化酶溶液,同時按動秒錶。
在連續15min內每隔1min於436nm處測一次吸光度
(2)計算:用以下公式計算活性:
式中:e436――每分鐘吸光度的變化(436nm處)(15次的平均值)
ew――0.1ml所用酶液中含酶的重量(0.000074mg)
8.3――1μmol鄰-聯二茴香胺/ml的吸光度(436nm處)
3.1――反應混合物的總體積
u1=53.25u/ mg; u2=93.21u/ mg; u3=13.30u/ mg
測酶活性(118u/mg)的實驗5(061218)
(1)操作步驟:將333μlβ-d-葡萄糖溶液、67μl在冰水中冷卻過的過氧化物酶(辣根過氧化酶)溶液和1.6ml鄰-聯二茴香胺溶液滴入乙隻1cm的比色皿內,調溫至25℃,最後加67μl酶於待測的葡萄糖氧化酶溶液,攪拌均勻(攪拌同時計時,共用8s,),然後重新按動秒錶。
在連續15min內每隔1min於436nm處測一次吸光度
(2)計算:用以下公式計算活性:
式中:e436――每分鐘吸光度的變化(436nm處)(15次的平均值)
ew――67μl所用酶液中含酶的重量(0.00004958mg)
8.3――1μmol鄰-聯二茴香胺/ml的吸光度(436nm處)
2.067――反應混合物的總體積
god:
15min的平均值:
u1=181.23u/mg; u2=167.36u/ mg; u3=156.11u/ mg
4min的平均值:
u1=156.56u/ mg; u2=129.89u/ mg, u3=134.97u/ mg
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