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葡萄籽原花青素的提取和檢測方法
1 葡萄籽原花青素的概念、性質和安全性
1．1 原花青素的概念
研究表明，葡萄籽中原花色素物質只有原花青素 一種[21。關於原花青素的定義還不統一。原花青素因在 酸性介質中加熱產生紅色的花青素而得名，而兒茶素 類單體在熱酸條件下反應沒有花色素現象，所以兒茶 素單體應不屬於原花青素。
這個概念也得到了美國葡 萄籽方法評定委員會和國內主要生產葡萄籽提取物的企業認可。葡萄籽原花青素是由兒茶素、表兒茶素及其 沒食子酸酯通過c4-c 或c4-c。鍵共價相連組成的多 聚體 ，結構通式見圖l【5j。
通常把二～四聚體稱為低聚 體(opcs)，五聚體及五聚體以上的稱為高聚體。
r=3p—oh兒茶素，r=3p—o一沒食子酸兒茶素o一沒食子酸酯 r-3a-oh表兒茶素。r-3a-o一沒食子酸表兒茶素o-沒食子酸酯
圖1 原花青素的結構及其組成單元
1．2 原花青素的主要性質
原花青素在熱酸條件下能夠生成紅色的花青素，此性質可用於原花青素的定性和定量分析。結構中具 有較多的羥基，具有較大的極性，使其能夠很好的溶解 於水、甲醇、丙酮、乙醇等極性溶劑而不溶解於苯、氯 仿、石油醚等非極性物質。較多羥基結構也使其成為良 好的氫原子給予體，具有較強的抗氧化性質。
研究表 明，在0 一、·oh、·ch，中，原花青素對0：一·清除能力最 好，而且在聚合度2～5之間範圍內，隨聚合度增加而增 加柳。對其構效關係分析表明，帶有沒食子醯基的原花青 素具有更強的抗氧化活性，二聚體的抗氧化活性均比單 體兒茶素的活性強。
c 一c 連線的二聚體比c 一c 連 接的二聚體具有更強的抗氧化活性 。原花青素的最大 吸收波長在280 nm附近，使其具有較強的紫外吸收能 力。以上的主要性質使原花青素很好的用於保健食品 和化妝品的開發。
13 原花青素產品的安全性
美國creighton大學葡萄籽原花青素研究組與美 國環境保護局根據有毒物質控制條例健康效果測試手 冊協同進行了葡萄籽原花青素萃取物(gspe)的一系 列毒性和生物功效研究。結果證明gspe具有很高的 安全性和很好的清除自由基、抗氧化能力。日本學者 yamakoshi等也採用一系列毒理性試驗確證富含原花 青素的葡萄籽提取物具有很高的安全性。
完全可以用 於功能性食品的開發.
2 原花青素的提取方法
提取原花青素常用的方法有水提取法、有機溶劑一 水提取法和儀器輔助提取法。葡萄籽中的原花青素物 質通常以結合態與蛋白質、纖維素結合在一起fl01，一般 不易提出，通常選用有機溶劑或水提取，具有斷裂氫鍵 的作用。同時由於有機溶劑的滲透性較差，一般不單獨 使用，常需要水作為傳質劑。
2．1 水提取法
masquelier~l-嘬早從松樹皮中用沸水粗提、乙酸乙 酯純化得到原花青素。選水作為提取劑，浸提耗時長， 溫度高，容易造成原花青素的損失。同時水的極性較 大，溶出雜質也較多。
2．2 有機溶劑一水提取法
甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯是提取葡萄籽原花青 素常用的有機溶劑，它們對原花青素有很好的溶解性， 它們的極性大ii,jt~序為甲醇》乙醇》丙酮》乙酸乙酯。 乙醇是常用的提取溶劑，**低廉，**豐富。乙酸乙 酯提取出的原花青素成分生物活性較好，但是由於極 性較小，對原花青素的提取並不完全。
甲醇和丙酮水溶 液(50％～75％)對原花青素都有較好的提取效能，同時也多用做原花青素含量測定時的提取溶劑。熊何 -21比 較了甲醇、乙醇、丙酮水溶液對多酚的提取效果，結果 表明70％丙酮水溶液為最好溶劑。丙酮水溶液提取效 果好的原因：
原花青素分子含有多個苯環和醚鍵，油溶 性較強，同時又有大量的羥基連線在分子骨架上，在水 中具有很好的溶解性，擁有油水雙溶性的丙酮與之相 互匹配，原花青素的溶解度自然增加，其提取率相應得 到提高。
2-3 儀器輔助提取法
超臨界萃取和超聲波輔助提取越來越多的用於葡 萄籽原花青素的提取。超臨界co：萃取率高，而且使原 花青素不受到空氣和光的影響，但由於裝置昂貴，推廣 使用比較困難。
超聲波法應用比較廣泛，超聲波產生的 強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應、攪拌等特殊 作用，可以破壞植物的細胞壁，使溶劑滲透到細胞中， 令其中的化學成分溶於溶劑中，從而提高提取效率。 在提取原花青素之類的熱敏性物質顯示出優越的性 能.
3 葡萄籽原花青素的檢測
由於葡萄籽和葡萄籽提取物中大多數多酚是原花 青素(一般佔70％～85％)，所以很多廠家使用原花青 素來標定其中有效成分的含量。原花青素含量是反映 葡萄籽提取物或葡萄籽質量的關鍵指標，主要有兩個 指標，分別為原花青素值和原花青素含量。
3．1 原花青素值的測定
原花青素值的測定採用bates—smith法和poaer 法。原理：原花青素在酸性條件下加熱轉化為紅色的花 青素，而兒茶素、表兒茶素等黃烷一3一醇單體沒有此反 應(圖2)。
它們測出的結果是原花青素的相對含量，分 別用原花青素指數和pvu表示，是根據經驗公式求得 的。葡萄籽提取物中的原花青素指數一般在80～100之 間，pvu一般在250～350之間。
原花青素值只是相對含量，並非原花青素的真實 含量。據調查，同為原花青素值95的產品，多酚含量相 差15％，質量大相徑庭四。很多生產廠家使用原花青素 指數來表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量是錯誤的。
圖2 花青素生成反應 fig．2 reaction ofproducing cyaniding
3．2 原花青素含量的測定
原花青素的含量測定方法很多，也比較混亂。常用 的有以下幾種方法。
3．2．1 鐵鹽催化法
此方法的反應原理與原花青素值測定原理相 同，在計算原花青素的含量時使用了原花青素標準 品。fe¨、鹽酸為常用的催化劑和酸解劑。由於水、乙 醇為反應介質時吸光值很低，一般採用正丁醇為反 應介質【15-161。
通常的具體操作：取1．0 ml樣液(或原花 青素溶液)於10 ml刻度試管中，加入6．0 ml正丁醇一 濃鹽酸(95：5)與2％ 硫酸鐵銨溶液(溶解於2 mol／l 鹽酸)0．2ml，混勻，置於沸水浴中加熱40min後，立即 取出用冰水快速冷卻至室溫，在550 nm處測定吸光值。
此方法較簡便，而且對原花青素的選擇性反應較 好。鐵鹽催化法對反應體系中的含水量和fe 濃度要求 比較嚴格，一般要求含水量6％，fe 濃度4．5x10 ％， 而且過高的fe¨濃度對反應沒有影響【l51。傅武勝【l61 研究表明3％～4％為合適的含水量，fe 濃度選擇在 9．oxlo ％左右。
但是也有學者總結分析2％～6％含 水量對花青素的形成有抑制作用，稍高的fe¨濃度 (>15 g／l)也抑制花青素的生成.
在鐵鹽催化反應的基礎上，楊大進【l i等人利用高 效液相色譜法檢測了原花青素含量。該方法將原花青 素在上述鐵鹽催化條件下生成的深紅色花青素離子 進行高效液相色譜分析，從而確定原花青素的含量。 此方法能夠排除部分雜質的影響，具有定性定量準確 的優點。
3．2．2 香草醛法
測定原理：原花青素和兒茶素類單體的a環的化 學活性較高，在酸性條件下，其上的問苯二酚或間苯 三酚與香草醛發生縮和，產物在濃酸作用下形成紅色 的正碳離子，樣品的濃度與產生的顏色呈正相關，在500 llm波長下測定其吸收光值【l91(圖3)
圖3 酚醛縮合反應
香草醛法測定時，一般以兒茶素為標準物，以甲醇為溶劑。鹽酸、硫酸均可作為反應過程的催化劑，但在 使用硫酸時，濃度不易過高，過高的硫酸易使香草 醛發生自縮合反應和氧化分解 。具體的操作方式 較多：
1 ml試液+2．5 ml 1％香草醛甲醇溶液+2．5 ml 25％硫酸或8％鹽酸(均溶解於甲醇)，30。【二下反應 15 min～20 min【2l。醜 ；1 ml試液+6 ml 4％香草醛甲醇 溶液+3 ml濃鹽酸，室溫下反應15 minl231；有的更是在 2o℃下反應15 h[241。
操作方式差別較大，不利於使用 者的選擇，有待於統一。
3．2_3 紫外分光光度法
原花青素為無色物質，在可見光區無特徵吸收峰， 在紫外區有唯一特徵吸收峰，最大吸收波長在280 nm 處。儘管此方法簡單快捷，但是此方法只適用於原花青 素含量純度特別高的產品，不適合一般原料中原花青 素的檢測。這是因為兒茶素類在280 nm處也有最大吸 收，v 、vc、ve。
、ve 、蘆丁、b一胡蘿蔔素等物質在此波長 處都有明顯的吸收.
3．2．4 folin—ciocaheau與hplc結合法
此方法為美國葡萄籽方法評定委員會推薦使用的 方法。folin—ciocaheau法測定的是多酚含量，一般以沒 食子酸為對照物。在鹼性溶液中，多酚可以將鎢鉬酸還 原，生成藍色的化合物，在760 nm處有最大吸收。
葡萄 籽提取物中的多酚含量一般在75％～95％之間。利用 hplc測定沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒 食子酸酯四種單體的含量來代表單體的總量。這是因 為它們四種單體的含量佔到了葡萄籽提取物中單體含 量的90．0％以上。
原花青素的含量則為多酚含量與單 體含量相減之差。
此方法缺點是蛋白質、氨基酸、核酸、抗壞血酸等 易被氧化的物質也參與folin—ciocalteau反應。同時由 於葡萄籽提取物中沒食子酸含量甚微(0％～1．2％)，與 兒茶素(1．5％～7．3％)和表兒茶素(2．0％～5．1％)含量 相差懸殊四，原花青素含量用沒食子酸量來表示缺乏 代表性。
3．2．5 鉬酸銨分光光度法
它是基於鄰苯二酚與鉬酸銨在弱酸性介質中生成 黃色鉬酸酯，反應產物在333 nm波長處具有最大吸收。 馬亞軍 寸檢測條件進行了簡單摸索：取0．08 mol，l鉬 酸銨1 ml溶液置於25ml比色管，加人適量試液，用 1．oxlo mol／l鹽酸衝至刻度，反應瞬間完成。
根據反應原理，花色素、沒食子酸、兒茶素類都具 有鄰苯二酚結構，也參與鉬酸酯的生成，測定原花青素 的選擇性不高，受到雜質影響較大。
3．2．6 其它測定方法
馬亞軍 對原花青素含量測定方法進行了研究： 高鐵鹽一鐵***分光光度法，它是基於原花青素能將 fe 還原成fe ，fe 與鐵***生成可溶性深藍色配 位化合物，在710 nm處有最大吸收的原理；硫酸高鈰 銨分光光度法，它是基於原花青素與ce“在強酸性介 質中反應生成無色的ce ，ce“在319 nm波長處具有 最大吸收，通過測定黃色高鈰鹽的吸光度，間接測定原 花青素。另外還有流動注射一抑制化學發光法[271：
在鹼 性條件下，利用原花青素還原h：o：可抑制魯米諾一 h20 體系的化學發光，其抑制的程度與原花青素濃度 之間呈線性關係。
這三種方法如同folin—ciocaheau法 利用多酚的還原性質測定多酚含量的原理，結果都擴 大了原花青素的含量。
綜上所述，原花青素值的測定只是根據經驗公式， 並不是原花青素真實含量，與現代檢測方法相落伍。鐵 鹽催化法測定原花青素專屬性較強，有很好的應用前 景，但仍需要進一步的研究與改進。香草醛法測定的是 原花青素和黃烷一3一醇單體的總量，與hplc法檢測黃 烷一3一醇單體：
兒茶素、表兒茶素含量相結合起來可以 計算原花青素的含量。但是香草醛法操作方式較多，不 利於使用者選擇，具體操作方法還需要進行統一。國外 有學者利用hplc／ms技術分析和檢測原花青素，過程 比較複雜，技術要求高，不能廣泛應用於原花青素產品 的測定。
4 展望
葡萄籽原花青素擁有高效的抗衰老、抗心血管疾 病、抗癌功能，此外還具有抗輻射、抗疲勞，改善記憶力 等作用，顯示出了無比的優越生物活性和安全性。目前 我國生產和銷售葡萄籽提取物就有50多家，年生產能 力超過80 t。因此，為了與葡萄籽提取物行業的蓬勃發 展相適應，迫切需要建立起統一的葡萄籽及其產品中 原花青素含量的測定方法，以利於企業的生產**、產 品的質量控制和顧客的消費指導。