影響DNA凝膠電泳結果的因素有哪些

時間 2021-09-04 19:21:04

1樓:聲業長孫永

電流強度與釋放出熱量(q)之間的關係可列成如下公式,則越慢;t為電泳時間.

因此、焦耳熱.在電場作用下影響電泳泳動度的因素:

1.反之,則降低顆粒的泳動速度、篩孔.

3.公式表明.一般來說顆粒帶淨電荷量越多,帶電顆粒的泳動速度越快,常常會有一些離子基團如羧基,在篩孔大的凝膠中溶質顆粒泳動速度快,此溶液層會向負極移動、顆粒性質.

電場強度越高、電滲,多用於分離小分子物質,電泳過程中釋放出的熱量與電流強度的平方成正比、電場強度.高壓電泳時間短:主要是指電極溶液(緩衝溶液)和蛋白質樣品溶液的ph值:

電場強度是指每一釐米的電位降:顆粒的直徑;釐米:當支援物不是絕對惰性物質時,則加快顆粒的泳動速度:

在電泳過程中.反之、形狀及所帶靜電荷量對泳動速度有較大影響:支援物瓊脂和聚丙烯醯胺凝膠都有大小不等的篩孔,則泳動速度慢、羥基等吸附溶液中的正離子.

反之.4,或其形狀越接近球形,而且在嚴重時會燒斷濾紙或熔化瓊脂糖凝膠支援物,有時僅需數分鐘,在電場中的泳動速度就越快.高壓電泳常需要冷卻裝置.前者電場強度為2-10伏特/、溶液的性質.

反之則越慢,後者為70-200伏特/.這種溶液層的泳動現象稱為電滲,當顆粒的泳動方向與電滲方向一致時.

2、離子強度和粘度等.又稱為電位梯度或電勢梯度、磺酸基.它對泳動速度起著十分重要的作用,溫度和儀器裝置等因子的影響也應考慮.

根據電場強度(電壓的高低)大小,又可將電泳分為常壓電泳(100-500v)和高壓電泳(500-10000v).

6;釐米.常壓電泳多用於分離大分子物質.這不僅降低解析度.

5.當電場強度或電極緩衝液中離子強度增高時,使靠近支援物的溶液相對帶電.

除上述影響泳動速度的因子外;i為電流強度:

q=i2rt

式中r為電阻,若支援物的離子基團吸附溶液中的負離子,則溶液層會向正極移動;當顆粒的泳動方向與電滲方向相反時,電流強度會隨著增大

2樓:bai清雅

dna分子特性和電泳條件。

⑴dna分子大小 dna分子越大在膠中的摩擦阻力就越大,泳動也越慢,遷移速率與線狀dna分子質量的對數值成反比。

⑵dna分子構型 對於質粒dna分子即使具有相同分子質量,因構型不同也會造成電泳時受到的阻力不同,最終造成泳動速率的不同。常規電泳中質粒dna分子的3種構型泳動速率:超螺旋最快、線狀分子次之,開環分子最慢。

⑶不同的膠濃度 對於同種dna分子膠濃度越高,電泳速率越慢。不同膠濃度對於dn**段呈線性關係有所區別,濃度較稀的膠線性範圍較寬,而濃的膠對小分子dn**段呈現較好的線性關係。所以常規實驗中對於小片段dna分子的分離採用高濃度的膠分離(有時甚至用2%的凝膠),而對於分離大片段則用低濃度的凝膠。

⑷電場強度

⑸溴化乙錠 簡稱eb,電泳中的染色劑,具有扁平結構,能嵌入到dna鹼基對間,對線狀分子與開環分子影響較小而對超螺旋態的分子影響較大。當dna分子中嵌入的eb分子逐漸增多時,原來為負超螺旋狀態的分子開始向共價閉合環狀轉變,電泳遷移速度由快變慢;當嵌入的eb分子進一步增加時,dna分子由共價閉合環狀向正超螺旋狀態轉變,這時電泳遷移速率又由慢變快。這個臨界點的遊離eb質量濃度為0.

1g/ml~0.5g/ml,即電泳時所加的濃度。因此一般電泳可以忽略此因素,而對於特殊電泳,消除此因素影響可採用電泳後染色。

⑹電泳緩衝液

用瓊脂糖凝膠電泳分析核酸(dna和rna)有哪些影響因素?

3樓:匿名使用者

核酸分子是兩性解離分子,在高於其等電點的電泳緩衝液中,其鹼基不解離,而磷酸基團全部解離,核酸分子因而帶負電荷,電泳時向正極遷移。瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來並經糖基化修飾,為一種聚合鏈線性分子,使用瓊脂糖凝膠作為電泳支援介質,發揮分子篩功能,使得大小和構象不同的核酸分子的遷移率出現較大差異,從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠電泳操作簡單、快速,通過調整其使用濃度,使得解析度達到大多數實驗的要求,因此成為分離、鑑定、純化核酸分子的常用方法。

但操作過程中仍有不少要注意的問題。

1 凝膠製作

1.1 凝膠濃度 配製凝膠的濃度據實驗需要而變 ,一般在0.8% ~2.0%之間,如果一次配製凝膠100 ml,沒用完的凝膠可以再次融化,但隨著融化次數的增加,水分丟失也越多,凝膠濃度則會越來越高,導致實驗結果不穩定,補水辦法:一是在容器上標記煮膠前的刻度,煮膠後補充相應的水分至原刻度;二是在煮膠前稱重,煮膠後補充水至原重量。粗略一點的方法是通過多次較恆定的煮膠條件得出一個經驗補水值。

以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。核酸染色劑溴化乙錠(ethidium bromide)可加在融化的瓊脂糖中,終濃度為0.5 t*g/ml;也可在電泳結束後染色。

1、2 梳板的選用 一般每個制膠模具均配有多個齒型不同的梳板,梳齒寬厚,形成的點樣孑l容積較大,用於dna 片段**實驗等;相反,梳齒窄而薄,形成的點樣孑l容積就較小,用於pcr產物、酶切產物鑑定等。梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定,一般來說,上樣量小時儘量選擇薄的梳板制膠,此時電泳條帶緻密清晰,便於結果分析。另外,每次制膠時都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm,否則,拔梳板時易損壞凝膠孑l底層,導致點樣後樣品滲漏。

當然,點樣孑l的破壞還與拔梳板的時間和方法有關,一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板,應急的情況下可以將成型的凝膠塊放4℃ 冰箱中冷卻15 min 左右,拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩衝液中,然後垂直向上慢慢用力,因為有液體的潤滑作用,梳板易拔出且不易損壞點樣孑l。

2 點樣

點樣需加上樣緩衝液,因為上樣緩衝液中加了甘油或蔗糖增加密度,使樣品沉入孑l底;指示樣品的遷移過程,上樣緩衝液中一般加了兩種指示劑,溴酚蘭和二甲苯青(值得注意的是指示劑並非染色劑,dna染色劑是溴化乙錠,而且要在紫外光的激發下才能看見桔紅色熒光)。上樣緩衝液儲存液一般為6× (10×),表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時上樣緩衝液應稀釋到一倍濃度。

點樣方法是將移液器基本垂直點樣孑l,用另一隻手幫助固定移液器下端,移液器槍頭(tip)尖端進入點樣孑l即可將樣品注入孑l內,千萬不可將tip尖插至孑l底,並點上適合的dna分子量標準,所謂適合是指樣品dna分子量大小應基本在dna分子量標準範圍之內。

3 電泳

將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連,負極與負極相連,核酸帶負電荷,從負極向正極移動。電泳槽中電泳緩衝液與制膠用電泳緩衝液應相同,電泳緩衝液剛好沒過凝膠1 mm 為好,電泳緩衝液太多則電流加大,凝膠發熱。電泳時凝膠上所加電壓一般不超過5 v/cm(指的是正負電極之間的距離,而不是凝膠的長度),電泳時間一般為3o~60 min,根據實驗需要也可作適當調整,電壓增高,電泳時間縮短,核酸條帶相對來說不夠整齊,不夠清晰;相反,電壓降低,電泳時間較長,核酸條帶整齊清晰。

另外,如果電泳後樣品泳動很慢或者沒泳動,請檢查膠模兩端的封口膠條是否已去掉。

4 結果分析

較成功的電泳結果是分子量標準條帶整齊清晰,樣品條帶也整齊清晰,如果條帶模糊暗淡,單從瓊脂糖凝膠電泳角度來說,可能的原因:溴化乙錠的質和量怎樣?溴化乙錠見光易分解,母液配製時間過長或儲存不當(一般4℃ 避光儲存一年內有效),或者終濃度沒達到0.5 vg/ml;電泳槽中緩衝液使用次數過多,緩衝能力下降。

特別是tae緩衝液,一般用2~3次就要更換,tbe緩衝液則可使用10次左右。

實際工作中經常發現dna 分子量標準小片段模糊不清,那足因為瓊脂糖凝膠濃度一般不會超過2 0% ,較小的核酸片段在它的分辨範圍之內,並且eb帶正電荷,電泳時會向負傲移動,如果將凝膠置含eb(0.5#g/m1)的水溶液中30 min,較小的片段則可重新染色:另外,溴化乙錠(eb)是一種中等強度誘變劑,操作過程中要戴手套,並將加有eb的染色液作好標記、妥善儲存

瓊脂糖凝膠電泳marker的作用

瓊脂糖凝膠電泳marker的作用是分子標記。dna分子標記具有的優越性有 大多數分子標記為共顯性,對隱性性狀的選擇十分便利 基因組變異極其豐富,分子標記的數量幾乎是無限的 在生物發育的不同階段,不同組織的dna都可用於標記分析 分子標記揭示來自dna的變異 表現為中性,不影響目標性狀的表達,與不良性...

誰知道凝膠電泳中mark的作用機制

茗荷兒 dna marker 即標準dna,當然是dna了,要不怎麼能用來對比確定dna的分子量呢。marker是經過特殊酶切消化的dna 可能也有人工合成的,我也不太清楚 dna被切割成大小不等的片段,而切割位點是已知的,這樣marker中有哪些片段 片段的大小就是確定的了。所以電泳時可以跑出許多...

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