1樓：陳剛
自從engvall和perlman(1971）首次報道建立酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbentassays,elisa）以來，由於elisa具有快速、敏感、簡便、易於標準化等優點，使其得到迅速的發展和廣泛應用。儘管早期的elisa由於特異性不夠高而妨礙了其在實際中應用的步伐，但隨著方法的不斷改進、材料的不斷更新，尤其是採用基因工程方法製備包被抗原，採用針對某一抗原表位的單轉殖抗體進行阻斷elisa試驗，都大大提高了elisa的特異性，加之電腦化程度極高的elisa檢測儀的使用，使elisa更為簡便實用和標準化，從而使其成為最廣泛應用的檢測方法之一。
如今elisa方法已被廣泛應用於多種細菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面，elisa在豬傳染性胃腸炎、牛副結核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍舌病等的診斷中已為廣泛採用的標準方法。 過氧化物酶（hrp）廣泛分布於植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（hrp），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種醣蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為ph 3-9，催化反應的最適ph值因供氫體不同而稍有差異，一般多在ph 5左右。
此酶溶於水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以rz表示：rz=od403/od275
純酶的rz多在3.0以上，最高為3.4。
rz在0.6以下的酶製品為粗酶，非酶蛋白約佔 75%，不能用於標記。rz在2.
5以上者方可用於標記。hrp的作用底物為過氧化氫，催化反應時的供氫體有幾種：⑴鄰苯二胺（opd），產物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數小時內不改變,是目前國內elisa中最常用的一種；⑵聯大茴香胺（od），產物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩定；⑶5－氨基水楊酸(5－as）：
產物為深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；⑷鄰聯甲苯胺（ot）產物為藍色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。 良好的酶結合物取決於兩個條件：即高效價的抗體和高活性的酶。
抗體的活性和純度對製備標記抗體至關重要，因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯，常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的hrp標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標記效果好，特別適用於實驗室的小批量製備。其標記程式為：
將5μg hrp溶於0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配製的0.06 mol/l的過碘酸鈉（naio4）水溶液0.
5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘 ， 取出加入0.16mol/l的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘後加入含5g純化抗體的水溶液1ml，混勻並裝透析袋，以0.
05mol/l、ph9.5的碳酸鹽緩衝液於4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時（或過夜）使之結合，然後吸出，加硼氫化鈉（nabh4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時，將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘後離心，將所得沉澱物溶於少許0.
02mol/l、ph7.4pbs中，並對之透析過夜（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標抗體，用0.02mol/l、ph7.
4pbs稀至5ml，進行測定後，冷凍乾燥或低溫儲存。 測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和igg含量、酶與igg摩爾比值以及結合率。
⑴ 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉澱線，經pbs漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸於酶底物溶液中著色，如果出現應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結合物在顯色後，瓊擴滴度應在1:16以上。
另乙個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以elisa方法進行方陣滴定，此法不僅可以測定標記效果，還可以確定酶標抗體的使用濃度。
⑵ 結合物的定量測定 一般是對結合物中的酶和igg進行定量測定。常用紫外分光光度計於403nm和280nm進行測定，然後按下列公式計算：
酶量（mg/ml）=od403×0.42
igg量（mg/ml）=（od280－od403×0.4）×0.94×0.62
對於過碘酸鈉氧化法製備的標記抗體量，按下列公式計算：
igg量（mg/ml）=（od280－od403×0.34）×0.62
已知酶量和igg量後，即可計算出標記抗體的摩爾（mol）比值。
hrp/igg摩爾比值=hrp（mg/ml）/igg（mg/ml）×4
結合物中酶總量=hrp（mg/ml）×結合物溶液量
結合物產率=結合物中酶總量/標記時加入的酶量×100%
用於elisa的結合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達 1000(g/ml時效果最好。mol.比值由於結合物中含的igg並不完全可靠，所以不能作為主要引數。
一般認為mol.比值為0.7時效果一般，1.
0時效果較好，1.5-2.0時最好。
酶結合率為 7%時效果一般，為9%－10%較好，達30%以上時最好。
elisa方法的基本型別、用途及操作程式
根據elisa所用的固相載體而區分為三大型別：一是採用聚苯乙烯微量板為載體的elisa，即我們通常所指的elisa（微量板elisa）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的elisa，稱為斑點elisa（dot-elisa）；再一類是採用疏水性聚脂布作為載體的elisa，稱為布elisa（c－elisa）。在微量板elisa中，又根據其性質不同分為間接elisa、雙抗體夾心elisa、雙夾心elisa、競爭elisa、阻斷elisa及抗體捕捉elisa。
本法主要用於檢測抗體。以鴨病毒性肝炎（dvh）抗體的elisa為例，間接elisa的操作程式如下。
⑴ 材料
① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液；
② dvh包被抗原、酶標抗抗體、陰性及陽性dvh參考血清；待檢鴨血清；
③ elisa檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
⑵ 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋幹
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋幹
③ 加酶標抗體 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋幹
④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液
⑤ 用elisa檢測儀測定od值，並計算出p/n比值。
⑶ 結果判定 已知陽性血清與已知陰性血清的比值（p/n）≥2.1，而且已知陽性血清的od值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（p/n）≥2.
1，而且待檢血清的od值≥0.4，則判為陽性，否則判為陰性。 本法主要用於檢測大分子抗原。
現以檢測雞傳染性法氏囊病病毒（ibdv）的雙夾心抗體elisa為例介紹本法的操作程式。
① 加抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋幹
② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋幹
③ 加酶標抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋幹
④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液
⑤ 用elisa檢測儀測定od值。 此法與雙抗體夾心elisa的主要區別在於：它是採用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標記每一種抗體，還可提高試驗的敏感性。
此法的基本程式為：
① 加抗體（ab-1）包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋幹
② 加待檢抗原（ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋幹
③ 加用非同種動物生產的特異性抗體（ab-2)→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋幹
④ 加入酶標抗ab-2抗體（ab-3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋幹
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑥ 用elisa檢測儀測定od值。 此法主要用於測定小分子抗原及半抗原，其原理類似於放射免疫測定。其基本程式為：
① 抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋幹
② 加入待檢抗原及一定量的酶標抗原（對照孔僅加酶標抗原）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋幹
③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
④ 用elisa檢測儀測定od值。
被結合的酶標抗原的量由酶催化底物反應產生有色產物的量來確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結合的標記抗原的量就越少，有色產物就減少，這樣根據有色產物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優點在於快速、特異性高、且可用於小分子抗原及半抗原的檢測；其主要不足在於每種抗原都要進行酶標記，而且因為抗原的結構不同，還需應用不同的結合方法。此外，試驗中應用酶標抗原的量較多。
本法主要用於檢測型特異性抗體。該方法現已成為豬傳染性胃腸炎（tge）、豬偽狂犬病（pr）及豬胸膜肺炎（ap）的主要檢測方法。下面以ap2型抗體的阻斷elisa檢測法為例介紹其操作程式：
① 100μl ap2型工作量抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋幹
② 用200μl阻斷緩衝液進行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋幹
③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋幹
④ 加100μl工作量兔抗ap2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋幹
⑤ 加100μl工作量豬抗兔igg-hrp → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋幹
⑥ 加100μl opd底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑦ 用elisa檢測儀測定od值。
本試驗同時設標準陰、陽性血清對照、兔抗ap2型陽性對照、空白對照。 本法主要用於檢測igm抗體。由於igm抗體出現於感染早期，所以檢測出igm，則可作為某種疾病的早期診斷。
抗體捕捉elisa根據所用標記方式不同可分為標記抗原、標記抗體、標記抗抗體捕捉elisa等幾種，其中以標記抗原捕捉elisa比較有代表性，該方法的主要程式為：
① 用抗u鏈（抗igm重鏈）抗體包被→37℃ 60分鐘後置4℃過夜，洗滌三次、拋幹
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋幹
③ 加酶標抗原 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋幹
④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑤ 用elisa檢測儀測定od值。 與常規的微量板elisa比較，dot-elisa具有簡便、節省抗原等優點，而且結果可長期儲存；但其也有不足，主要是在結果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程式為：
⑴載體膜的預處理及抗原包被 取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡後，稍加乾燥進行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋後加入圈中，置37℃使硝酸纖維素膜徹底乾燥。每張7cm×2.
3cm的膜一般可點加40－53個樣品，每個壓圈可加抗原液1－20μl。
⑵ 封閉 將硝酸纖維素膜置於封閉液中，37℃感作15－30分鐘。封閉液多採用含有正常動物血清、ph7.2或ph7.4的pbs。
⑶ 加被檢血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置於微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37℃反應一定時間，用洗滌液洗三次，每次1－3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的pbs-tween溶液。
⑷ 加酶標抗體，37℃反應一定時間後，用洗滌液洗三次。
⑸顯色 加入新鮮配製的底物液，37℃反應一定時間後，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應。
⑹ 結果判定 以陽性、陰險血清作為對照，膜片**出現深棕紅色斑點者為陽性反應，否則為陰性反應。 （c－elisa） c－elisa（cloth-elisa）是加拿大學者blais,b. w.
等於2023年建立的一種新型免疫檢測技術。該方法是以疏水性聚脂布（hydrophobic polyester cloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應提供較大的表面積，提高反應的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優點。其基本原理與dot-elisa類似，只是載體不同。
以對布氏桿菌抗原的檢測為例，c－elisa的主要程式為：
⑴ 首先把抗布氏桿菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，並經洗滌及封閉；
⑵ 加被檢樣品並於室溫下感作30分鐘，然後洗5次；
⑶ 加酶標記的抗布氏桿菌抗體，於室溫下感作30分鐘，然後洗滌5次；
⑷ 加入底物液顯色；
⑸ 測定od值。
酶聯免疫吸附實驗測艾滋病毒要多長時間
elisa方法敏感性高，但是存在一定機率的假陽性。所以如果elisa陽性，一般都是需要再做免疫印跡法的檢測來確診的。 可靠，但確診還需要做免疫印跡的方法才能確診。 斬斷流水 酶聯法是主流的檢測方法，有效，可信，可靠 人抗人類免疫缺陷病毒抗體 hiv elisa kit 可靠 hiv的檢測步驟有哪些 ...