1樓：南京金益柏生物科技****
模板量有時侯太大，pcr擴增會出不來，降低模板量試試。
2樓：匿名使用者
pcr反應的關鍵環節有①模板核酸的製備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④pcr迴圈條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除淨，特別是染色體中的組蛋白，④在提取製備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。
在酶和引物***時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程式亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是pcr失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：
①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做pcr有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應高濃度小量分裝儲存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
mg2+濃度：mg2+離子濃度對pcr擴增效率影響很大，濃度過高可降低pcr擴增的特 異性，濃度過低則影響pcr擴增產量甚至使pcr擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行pcr擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行pcr擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對pcr擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低pcr擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其pcr擴增是不會成功的。
elisa中的正對照和負對照什麼意思
3樓：南京金益柏生物科技****
陽性對照品（positive control）和陰性對照品（negative control）是檢驗實驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照，因此對照品，特別是陰性對照品的基本組成應儘量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種elisa模式中可產生不同程度的本底。由於大量正常人血清較難得到，國外elisa試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿（recalcified human plasma）為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質凝固，除去凝塊後所得的液體，其組成與血清相似。
陰性對照品須現行檢測，確定其中不含待測物質。例如檢測hbsag的陰性對照品中不可含hbsag，最好抗hbs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩衝液為基質，其中加入一定量的待檢物質，此量最好在elisa試劑盒說明書中標明。
加入的量應與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢的標本吸光值比較，可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估值。檢測hbsag的elisa試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中hbsag含量約為10ng/ml。
在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利儲存。
定量測定的elisa試劑盒應含有製作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測範圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩
僅供參考哈，詳細資訊還是要諮詢技術進行具體諮詢
定量pcr是否不能擴增太長的片段
4樓：北京索萊寶科技****
pcr可以達到10kbp，但要用high fidelity 的酶。定量pcr長度一般為100－200bp.短片段擴增效率較高，abi推薦50－150bp。
影響pcr擴增結果的因素請問影響pcr擴增結
5樓：南京金益柏生物科技****
我個人感覺對baipcr影響最大的是模板du質量和退火zhi溫度,至於其
他的影dao響因素那就太多了,模板專純度濃度,引物質量屬,體系中的物質（buffer,酶,mg2+,dntp濃度）,退火和延伸溫度.一般來講,引物從reference上找,然後參照reference上的體系稍作調整即可,有需要直接hi我吧,我不一定在,看到給你回
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