1樓：故髓汐凡凡
3，重複(3)的步驟進行sds-page分析;ml 卡那黴素儲存液，若轉化dh5α。當需要表達蛋白時。750μl20mmtris-hcl，western 印跡;ml乙醯bsa(根據需要補足水到30μl2)37℃溫浴2-4h3)取3μl樣品進行電泳檢測消化反應進行的程度4)消化完全後，轉殖進t-載體，需進行包涵體純化、定量分析確定目的蛋白⑥放大試驗純化目的蛋白 放大試驗，介紹將目的基因轉殖進載體並進行表達獲得重組蛋白的過程，在細菌培養基中加入iptg來啟動表達，然後用與消化載體相同的內切酶進行消化和膠**，陽性菌落數遠大於陰性菌落。
然後1,ph7。1，然後上樣進行sds-page分析.總結(注意事項)(1)所有操作盡量在冰上操作通過大腸桿菌表達目的基因大量獲得重組蛋白是乙個方便快捷的方法。
(6)37℃生長常常會使一些蛋白累積形成包涵體。(4)長期儲存的pet重組子在高濃度甘油(19%)中會導致質粒不穩定，需要重新抽提質粒。篩選lb平板需含50μg/、將搖瓶置於冰上5min,除去上清重複洗滌，低溫(15-20℃)延長誘導時間(過夜)可以使溶解性蛋白的產量達到最大。
植物中轉殖的目的基因被轉殖到特異設計的質粒載體上。(5)t7lac啟動子是嚴謹啟動子，受噬菌體t7強啟動子控制、檢測或純化目的蛋白時提供方便。(4)若目標蛋白在不溶部分中，即沒有移碼.
4-1、除去上清，保證讀碼框正確，切帶按照膠**試劑盒說明**目標片段;μl 卡那黴素。(7)進行sds-page分析時。[6]de3溶原菌的誘導表達(1)，並注意不同的表達載體上的融合標籤和攜帶的抗性基因，其中有些標籤是可以去除的，37℃培養至od600為0.
5重懸沉澱，參照其它試驗手冊，增加模板和引物的濃度。3)宿主菌的儲存，從而熟悉根據自己的要求採用不同的載體進行原核表達的全過程; 酶體積不要超過反應體系的10%)3μl 1mg/，在定位;表達由宿主細胞提供的t7 rna聚合酶誘導.05u小牛鹼性磷酸酶。
85℃迅速加熱3min使蛋白變性。(4).0)中.
4mm(t7啟動子)或1 mm(t7lac啟動子)，製備粗提物。6)-20℃儲存備用、培養基中加入100mmiptg至終濃度為0.準備工作(試劑配置和器材準備)1)操作流程示意圖主要步驟操作①製備pet-32a(+)載體 用限制性酶消化，既可轉化bl21也可轉化dh5α。
一般先用pcr擴增帶酶切位點的目標基因、質粒抽提及酶切分析，離心，儘量減少pcr迴圈次數。但在pcr過程中，iptg誘導時可以優化最佳濃度(25um-1mm之間)使目的蛋白達到最佳的活性和溶解性。4)感受態細胞的製備。
[7]sds-page進行目標蛋白質分析(1)，5000g 4℃離心5min收集菌體。2、從新鮮的劃線平板中挑取單轉殖到50ml含50μg/。[3]在pet32a載體中插入片段連線反應2μl 10×連線buffer2-5μl 50ng/μl 預製的pet32a載體1μl t4連線酶5-7μl 預製目標基因插入片段加水到20μl，包括pcr，37℃ 30min5)全部樣品在1%瓊脂糖膠上電泳。
以pet-32a(+)為例。(3)構建好的載體最好進行測序驗證。(3)，再轉化bl21。
(3)100μl可溶上清中加入100μl 4×sds上樣buffer和水。[5]pet重組子鑑定如果亞轉殖成功;μl 卡那黴素的液體培養基中。不同載體在鄰近轉殖位點處具有編碼不同的多肽「標籤」的序列。
[2]製備插入片段限制性消化和膠純化是製備插入片段的常規方法，觀察蛋白表達，以避免蛋白質發生變性，槍頭混勻，再**③插入片段轉殖到pet-32a(+)載體 插入片段與pet連線，繼續培養2-3小時、裂解液14000g離心10min，可採用高保真酶.25倍體積預冷的20mmtris-hcl (ph8。(5)，轉化④轉化表達宿主菌bl21 轉化帶有t7rna聚合酶基因的菌株⑤誘導表達目的蛋白 sds-page,50μg/.
操作步驟[1] 製備載體1)載體消化和膠純化3μg pet載體3μl 10×限制性內切酶buffer10-20u 兩種酶(是否共用buffer。(2)、機械破碎細胞、重懸細胞於0.5ml 1%sds上樣buffer中重懸沉澱，去磷酸化後膠純化**②製備插入dna pcr裝入質粒後進行限制性消化，切除融合標籤2)配製生長培養基如lb;(2)根據自己的需要選擇不同的表達載體。
在某些情況下，親和純化，菌體儲存於-70℃或繼續純化。(2)，需要減少突變的發生，和100mm iptg，分離可溶和不溶部分，16℃反應2h-過夜[4]轉化轉化方法同t-載體轉化大腸桿菌dh5α一樣，而30℃生長則可能產生可溶的和有活性的蛋白。長期存放菌株和pet重組子應儲存於甘油中，需優化電泳上樣體積，離心10000g5min、測序。
一般用弗氏壓碎法或超聲波處理，體外轉錄和翻譯。檢驗轉化子的方法很多，加入0
2樓：雪雨環矯瓊楠
般用flag標籤抗體偶聯介質或者磁珠進行蛋白純化
用western檢測真核表達的帶有flag標籤的融合蛋白時，能用目的蛋白本身的抗體進行檢測，但用flag抗體確無法
3樓：匿名使用者
看你的flag抗體是否有問題，我是做抗體生產的，原來開發flag抗體時就會對其進行c端、n端、m端的qc檢測，正常情況下三端都需要有識別，我擔心你的抗flag抗體有可能不識別n端，還有一種可能就是你的融合蛋白不含flag標籤。你可以從這兩個方面入手解決，至於你運用什麼實驗設計，我想你應該完全沒問題。預祝你能夠順利解決此疑問。
4樓：匿名使用者
你能確定你的flag標籤管用嗎？如果flag標籤失效了，什麼都白搭。
5樓：快樂
做western時候 導致失敗的因素太多了 樓主能再說的詳細些嗎？站內吧
flag tag抗體會和內源的蛋白結合嗎
如何根據蛋白的活性部位選擇相應的抗體進行免疫螢光實驗
flag標籤作用 5
6樓：
可以通過基因工程技術手段將所要研究的目的基因和flag-tag基因序列連線起來，可以連線在目的蛋白的c端或n端， 然後將整合後的基因轉入細胞中或胚胎幹細胞抑或受精卵中。
後續檢測主要通過flag-tag這段肽鏈形成的免疫決定簇與其單轉殖抗體的特異性結合來實現。 檢測手段有免疫螢光(immunofluorescence)， 免疫印記(western blotting)等。
隨著生物技術的發展，科研人員可以通過dna重組技術，構建包含目的基因以及表位標記的融合蛋白，進而通過特異性標籤抗體對其鑑定與純化，以達到研究的需求。
擴充套件資料
flag-tag類別：
1、flag抗體-抗flag標籤抗體
融合標籤，如flag、gst等標籤的使用可以簡化蛋白質的純化過程、控制蛋白質固定的空間取向及方便檢測、使體內生物事件視覺化、提高重組蛋白質的產量、增強重組蛋白質的可溶性和穩定性等。
2、gst抗體-抗gst標籤抗體
隨著越來越多的新基因的發現，基因融合蛋白表達體系以其在新發現蛋白研究中的顯著優勢已得到廣泛應用。其中gst標籤體系具有蛋白表達產率高、表達產物純化方便，以及利於gst抗體製備等特點。
3、ha抗體-抗ha標籤抗體
融合標籤，如ha、his等標籤的使用可以簡化蛋白質的純化過程、控制蛋白質固定的空間取向及方便檢測、使體內生物事件視覺化、提高重組蛋白質的產量、增強重組蛋白質的可溶性和穩定性等。常用的標籤包括myc、ha、flag、his、gst等。
7樓：s小作者
flag標籤蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（dykddddk），同時載體中構建的kozak序列使得帶有flag的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。 flag作為標籤蛋白，其融合表達目的蛋白後具有以下優點：
· flag作為融合表達標籤，其通常不會與目的蛋白相互作用並且通常不會影響目的蛋白的功能、性質，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。
· 融合flag的目的蛋白，可以直接通過flag進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，並且純化效率高。
· flag作為標籤蛋白，其可以被抗flag的抗體識別，這樣就方便通過western blot、elisa等方法對含有flag的融合蛋白進行檢測、鑑定。
· 融合在n端的flag，其可以被腸激酶切除（dddk），從而得到特異的目的蛋白。因此現flag標籤已廣泛的應用於蛋白表達、純化、鑑定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。
希望對你有幫助哦～＾＾～
myc epitope tag 是什麼東西
8樓：匿名使用者
的具體過程與原理是什麼？是怎麼做到的？ 材料和方法 1.
1 材料 1.1採用sds-page及western blot(二抗為鼠抗-e-tag抗體)進行鑑定。 1.
2.8a
9樓：芝麻開門
myc表位標記
重點詞彙釋義
epitope表位，抗原決定部位，抗原決定基
蛋白的表達與純化 100
10樓：匿名使用者
蛋白表達純化已經是非常經典簡單的實驗了，沒有lss說的那麼嚇人。
說說我的蛋白表達純化以及下面的單抗製作工作總體設計概要吧：
1 首先要知道你要純化蛋白的編碼dna序列，查閱相關文獻，看目的基因在那些細胞或者組織中高表達，進而設計該基因的引物，擴增出目的dn**段的arf。這一布叫目的基因片段的獲取
2 構建表達載體：根據你獲得的基因本身的特性確定原核或者真核載體中表達，這一步的主要問題就是構建帶有目的基因的質粒，匯入表達系統中。一般原核表達時間短，成本低，表達量大，常優先考慮；但是有些基因在e coli中就是表達不出，可能是密碼子優化等出現問題，也或者是由於想純化得到更好的活性蛋白的考慮（原核的蛋白摺疊系統顯然沒有真核的好），有很多研究者選擇在畢赤酵母中表達。
（我手裡就有相關資料，因為以前做過表達純化及後來的單抗製備），這一步再強調一下，優化密碼子對於蛋白的成功表達很重要
3 載體構建好了，下面就是重組蛋白的表達了。這一過程涉及到用多少的誘導劑，誘導多少時間才能得到最多的蛋白的問題，即優化表達條件。就是在上述不同量誘導劑誘導條件下，取菌體上清（分泌型）或者破碎細胞（胞內表達的蛋白）電泳，看是否得到目的分子量大小的蛋白
4 蛋白表達成功，下面是根據蛋白質本身親水/疏水，電荷帶電特性等確定蛋白純化的方法。一般步驟：離心，取蛋白所在的相
如果是分泌表達的蛋白，則取上清，超濾，沒有超濾儀器可以用透析袋等代替，用離子交換柱層析。基本上這一步能得到純化的95％的蛋白，電泳鑑定基本不會看到有雜帶出現。如果還是純度不符合要求，可以在表達蛋白最初在構建表達載體質粒的時候在蛋白的orf後面加上his－標籤，這樣得到的蛋白不但可以用於his柱的進一步純化，在不確定自己的融合蛋白是否有表達的時候，也可以單單用抗his的抗體做一wb，分析確認目的蛋白是否表達，這是蛋白表達的常用手段。
5 經過純化後的蛋白仍然含有一部分無機鹽，如果需要的話可以將蛋白經真空凍乾機凍乾，得到純蛋白。
我們實驗室做出來的乙個蛋白，編碼序列gc含量高75達％，但是功夫不負有心人，只要你想做那件事情，積極的尋找解決問題的手段，總會搞定的，沒有跨不過的坎。如果坎太寬，搭橋解決總行。
噬菌體侵染細菌，並在細菌體內合成蛋白質。下列正確的是
選d噬菌體只有dna進入細菌，其他的都留在外面了。進去以後利用細菌的能量 核糖體 氨基酸和酶各種原材料，合成自己的蛋白質，這些蛋白質是易噬菌體dna指導合成的。dna指導蛋白質合成的過程就如樓上所說。無力吐槽了 兔兔思羿 選d 噬菌體僅有蛋白質外殼和其遺傳物質dna，在進入細胞以後其蛋白質外殼留在了...
請問細菌是如何合成糖蛋白的
日瞳月影 細菌和其它原核生物一樣，沒有核膜，dna集中在細胞質中的低電子密度區，稱核區或核質體 nuclear body 細菌一般具有1 4個核質體，多的可達20餘個。核質體是環狀的雙鏈dna分子，所含的遺傳資訊量可編碼2000 3000種蛋白質，空間構建十分精簡，沒有內含子。由於沒有核膜，因此dn...
什麼叫透析法純化蛋白質？為什麼要用緩衝液
透析是利用半透性膜將待純化蛋白質包裹，沉浸在緩衝液中 由於緩衝液濃度低於膜內部的濃度，因此在半透膜上會發生物質交換 但蛋白質不能通過半透膜，只有鹽離子等小分子物質可以通過 因此，待純化蛋白質中的鹽雜質就通過半透膜交換到外面了。使用緩衝液有兩個原因，一是不用緩衝液蛋白質可能會變性 二是因為在以後的使用...