1樓：匿名使用者
這個時候一般是先製備感受態的大腸桿菌，一般是用cacl2處理，現在也有商品化的感受態，一般菌株為dh5α。具體制備方法搜一下“感受態細胞製備”就有。
然後一般取50-100ng質粒加入100ul的感受態細胞裡，進行熱激處理，這個操作方法網上也有，一般是感受態細胞（-70°c取出才有這一步）冰上融化，加入質粒，42℃保溫90s，冰上放置5min。
然後加入400ul lb培養基，37℃振盪培養0.5-1h（時間不要超過2h）。 取100ul培養液在固體培養基（lb固體培養基，一個平板裡大概30ml）上進行塗布（培養基需帶有質粒上相應的抗生素）。
培養12-24h後，可以挑單克隆（多挑幾個），在5mllb培養基中培養過夜（16h左右），留1ml儲存菌種（方法具體自己查一下），其餘的抽提質粒，5ml過夜培養液一般多拷貝質粒的話至少可以抽到10-20ug左右。
希望對你有幫助~都是自己實驗過程中的經驗~
2樓：淘歌
樓上guangyi1012回答的很具體了，我補充點大致方案：
大體來講分為3步：
1，將要回的質粒溶於無菌水；
2，轉化至大腸桿菌，培養細菌，也就是擴增質粒；
3，提質粒，並檢查其大小，測定濃度。
既然你沒做過這個實驗，我覺得你先做如下準備工作：（1）查清這個質粒的圖譜，弄清其受體菌有無特殊要求，以及質粒大小、抗性特徵。大多質粒都可以用dh5a菌株來擴增，抗性也大多為amp或者kana抗性；（2）準備無菌水、感受態細胞（你用的不多，就問周圍的同學借吧，若想自己做，方法樓上給了，但新手還是很可能出問題，比如汙染）、lb培養液及抗性lb平板、質粒提取試劑盒等。
把上述基本東西準備好，就可以做了，這3步具體的方法你若有不明，可繼續討論。
建議採納樓上guangyi1012的答案。
3樓：匿名使用者
在pcr管內配置100ul反應體系：雙蒸水70ul 10×buffer 10ul 2.5mol/l dntp混合產物 8ul 正向引物 4ul 反向引物 4ul 模板dna 2ul taq聚合酶 2ul
步驟：（1）94℃預變性2min
（2） 94℃變性30s
（3） 55℃退火30s
（4） 72℃延伸1min
（5）重複（2）（3）（4）30次 （pcr熱迴圈儀做）（6）72℃總延伸2min
誰用過博凌科為的質控型高純度質粒小量快速提取試劑盒，儲存要注意什麼呀？我們儲存出了問題
4樓：手機使用者
儲存事項：
1、第一次使用時，將試劑盒所帶的全部rnase a加入溶液p1後（終濃度100ug/ml）置於2-8℃儲存。如果溶液p1中rnase a失活，提取的質粒可能會有微量rna殘留，在溶液p1中補加rnase a即可。
2、環境溫度低時溶液p2中sds可能會析出渾濁或者沉澱，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
3、避免試劑長時間暴露於空氣中產生揮發、氧化、ph值變化，各溶液使用後應及時蓋緊蓋子。尤其100xbluelysis含有高濃度乙醇,更要及時封口膜封好,防止揮發。
博凌科為的產品和普通產品的區別在於配有bluelysis, 它是一種和質粒提取試劑盒配套使用的顏色指示劑。通過在溶液p1裡面加入bluelysis，可以直觀地通過顏色的改變監測質粒提取過程中菌體重懸是否充分、裂解是否均
一、中和沉澱是否完全，這樣可以避免一些常見操作問題（如因為裂解不充分或者中和沉澱不完全造成的產量降低，sds或者基因組dna殘留影響下游步驟等）。因此特別適合於經驗不太豐富初學者和希望確保每個操作正確並得到最大產量的富有經驗的研究人員。
真核生物（如小鼠）的質粒如何提取，請寫下詳細步驟，謝謝
5樓：匿名使用者
對於小鼠來說，質粒只存在於線粒體中
1 裂解細胞
2 質粒dna與染色體dna的分離
3 純化
這裡找到一篇**：
小鼠cd40ig基因真核表達質粒的構建及鑑定
1 材料和方法
1.1 實驗動物 balb-c小鼠，6周齡, 雌性, 購自北京大學醫學院實驗動物部。
1.2 質粒、菌株、細胞株和主要試劑 質粒pegfp-n1、pgem-t載體質粒、e coli.dh5a（天根公司）。
低代次hek293細胞株（本元正陽）。admaxtm kit e試劑盒（microbix biosystems，inc.）。
taq酶、t4 dna連線酶（takara公司）。限制性核酸內切酶xmaⅰ、bgl ii、hind iii（biolabs）。trizol 試劑、lipofectamine 2000（invitrogen）。
逆轉錄試劑盒、pcr master mix（mbi）。質粒提取、膠純化試劑盒（qiagen）。dmem高糖培養基、胎牛血清、胰酶（gibco）。
引物合成由上海生工公司完成，基因測序由北京諾塞基因研究中心****完成。
1.3 構建小鼠cd40ig基因真核表達質粒
1.3.1 小鼠脾臟總rna的提取：將小鼠以頸椎脫臼法處死，取出脾臟，加入液氮研磨後，用trizol試劑提取總rna，方法按產品說明進行。
1.3.2 cd40、igg2a fc、gfp基因的製備：
以小鼠脾臟總rna為模板，oligo-dt為引物，rt-pcr合成cdna，再以此cdna為模板，用cd40和migg fc特異引物進行pcr擴增，另以pegfp-n1質粒為模板進行pcr擴增，引物及pcr反應條件見表1，分別獲得cd40、migg2a fc和gfp基因。
1.3.3 質粒pgem-igg的構建：
將igg fc的pcr產物與pgem-t質粒進行ta連線反應，即10μl pcr產物加2μl的pgem-t載體加10 u的t4連線酶，16 ℃過夜。取2μl的連線產物以氯化鈣法轉化大腸桿菌dh5α，用藍白斑方法挑選含氨苄青黴素抗性的白斑克隆，在3 ml lb培養基（含氨苄青黴素100 μg/ml）中37 ℃、80 r/min振盪培養過夜，提取質粒pgem-igg並測序。
1.3.4 質粒p516-igg的構建：
用bgl ii分別消化pgem-igg和pdc516，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳後進行膠純化。將igg片段和pdc516線性載體按7:
1的摩爾濃度比例加t4連線酶16 ℃過夜進行連線反應。取5μl連線產物轉化感受態大腸桿菌dh5α，用pdc516-f和migg-r引物組合進行菌落pcr篩選正向插入的重組子（見表2），將pcr陽性的重組子進行細菌培養，提取質粒並測序。
1.3.5 質粒p516-cd40-igg融合基因的構建：
用xma i分別消化cd40的pcr產物和p516-igg，將cd40片段和pdc516-igg 線性載體進行連線（方法同上）。轉化大腸桿菌dh5α後，用pdc516-f和cd40-r引物組合進行菌落pcr篩選（見表2），將陽性結果的重組子進行細菌培養，提取質粒並測序。
1.3.6 pdc516-cd40-igg-gfp質粒的構建：
用hind ⅲ分別消化gfp的pcr產物和pdc516-cd40-igg，將gfp片段和pdc516-cd-igg 線性載體進行連線反應（方法同上），用gfp-f和pdc516-r引物組合進行菌落pcr篩選正向插入的重組子（見表2），提取質粒並測序。
1.3.7 pdc516-cd40-igg-gfp質粒的大量製備：
按qiagen endofree plasmid purification試劑盒說明進行製備，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳證實（見圖2），紫外分光光度儀測od值，過濾除菌後-20 ℃儲存備用。
1.3.8 重組質粒轉染293細胞：
在6孔板中將2.0×105個細胞接種於2 ml含血清不含抗生素的dmem中，在5% co2、37 ℃培養箱中培養24 h，使細胞在轉染時鋪滿平板的60%～70%。用lipofectamine 2000轉染試劑介導重組質粒轉染，在無菌ep管中準備a、b兩種溶液。
a液：將4.0μg dna溶於250μl無血清dmem中，輕輕混勻；b液：
將10μl lipofectamine 2 000溶於250μl無血清培養液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將a液和b液混合並混勻，室溫孵育20 min，以形成脂質體/dna複合物。換去6孔板中舊的培養液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的dmem，逐滴加入500μl脂質體/dna複合物。
在5% co2、37 ℃培養箱中培養24 h後換液。
2 結果
2.1 獲得小鼠cd40胞外區、igg2a fc段及gfp基因 引物cd40-f和cd40-r經pcr擴增的小鼠cd40胞外區基因片段為572 bp；引物migg-f和migg-r經pcr擴增的小鼠igg2a fc段為700 bp；引物gfp-f和gfp-r經pcr擴增的gfp基因片段為765 bp。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。
2.2 pdc516-cd40-igg-gfp真核表達質粒的成功構建
2.2.1 pdc516-igg的構建：
pgem-t載體為3 000 bp的質粒，構建的pgem-igg質粒為3 700 bp。pgem-t質粒的多克隆位點上游110 bp處含有t7 primer序列，用t7+migg-r引物組合可擴增出約810 bp的片段，用t7 primer測序證實igg序列的正確性。將igg片段和pdc516線性載體進行連線反應，用pdc516-f測序證實igg插入序列的正確性（見圖3）。
2.2.2 pdc516-cd40-igg的構建：將cd40片段和pdc516-igg線性載體進行連線反應，用引物pdc516-f測序證實cd40插入序列的正確性。
2.2.3 pdc516-cd40-igg-gfp質粒的構建：
將gfp片段和pdc516-cd40-igg 線性載體進行連線反應，用pdc516-r測序證實gfp插入序列的正確性。cd40-igg-gfp含酶切位點的融合產物為2001bp，編碼667aa（見圖4）。
2.3 重組質粒在真核細胞內表達 pdc516-cd40-igg-gfp質粒抽提後在紫外分光光度計下檢測到od值為0.1257。
將該質粒用lipofectamine 2000轉染293細胞的第4天開始可見零星的細胞上有gfp表達，隨著時間的延長，gfp表達的細胞量逐漸增多，第7天左右在熒光顯微鏡下見大量的細胞有綠色熒光發生（見圖5）。
參考資料：http://www.studa.net/yixue/081031/16370955-2.html
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