1樓：匿名使用者
根據你描述，體系可能性不大。所以給如下建議：
1. 檢查引物，確保正反向設計沒有問題，而且最後都是從5到3順序書寫並送交合成（這種錯誤很低階，但有人犯過，所以提醒，如果自己不很保證就讓別人把把關）。
2. 再次要求生工合成引物（合錯可能性有，不大），或者重新換位置設計引物
2. 由於是真菌，你用基因組還是cdna做模板？倘若後者要考慮你cdna質量是否夠好。前者，那麼可能內含子太多你pcr延伸時間不夠？
3. 嘗試溫度梯度pcr
4. 嘗試熱啟動pcr（特殊熱啟動酶，或者待遇變形快要結束時再加入taq）
5. 可以考慮用不含有mg的buffer，然後可以做mg梯度pcr
2樓：飛雪之靈
感覺你的上下游引物cg含量都很高啊。
你從55度到65度做乙個溫度梯度試試。
模板稀釋到在瓊脂糖上看不出來的濃度。
也可以去這裡問問。
3樓：
用touch down pcr試試， 還有你確定你的模板沒有問題麼？ 可以嘗試增加模板量，延長變性時間。
4樓：
我覺得可能出問題的地方有：
1.我一般用50微公升體系，dntp要用4微公升，你的dntp用量太少了2.引物量太多，你的體系加0.3微公升引物就足夠了，你加多了會形成引物二聚體
3.退火溫度要比tm值低一些
4.檢查你的taq酶是否還有活性
5.最後模板也檢查一下，別太著急了，每個因素都要考慮到哈
在做rt-pcr時，或者是一般的pcr時，退火溫度怎麼設定，退火溫度和tm值之間有怎麼樣的關係？謝謝
5樓：阿魯巴星人
不同的pcr mix所設定的退火溫度是不一樣的，有的比最低tm值低5℃，有的低迴3℃，請你參考你所買的pcr mix的說明
答書，上面肯定有詳細說明。
一般pcr比最低tm值低1-5℃，都沒什麼問題。
rt-pcr的文獻上，有推薦的設計軟體，也有推薦的pcr mix，跟著說明書做就沒有問題了。
6樓：匿名使用者
退火溫度和tm值有關，一般的說是在tm值下5度，我用的話一般在tm值下2-3度
7樓：櫻花淡淡
一般情況下退火溫度要比tm值低5℃
如何確定pcr反應中的退火溫度和延長時間
8樓：禾鳥
1、退火溫度低於引物tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的tm值（tm值=4(g+c) +2(a+t)）為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。
引物延伸一般在72℃進行（taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
擴充套件資料
pcr的過程：
1、dna變性：（90℃-96℃）：雙鏈dna模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈dna
2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與dna模板結合，形成區域性雙鏈。
3、延伸：（70℃-75℃）：在taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dntp為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的dna鏈。
9樓：匿名使用者
退火溫度一般是比你設計引物時的tm值低5度。不過這是要摸索的，用溫度梯度pcr。（順便說一下，如果你不想花時間摸索溫度，建議就用60度。
這個溫度是我原來做實驗時的萬能溫度。尤其對較短片段pcr適用）
延長時間是看pcr產物長度，一般認為常規taq酶一分鐘擴增1kb。比如你的pcr產物是500bp，你就用30秒。不過我一般會在這個基礎上再加5秒左右。
pcr反應退火溫度的高低與什麼因素有關
10樓：我的行雲筆記
退火溫度是影響pcr反應特異性的重要因素。
引物與模板復性所需要的退火溫度取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度。引物長度越短，引物中g+c的含量越低，所需的退火溫度越低。雖然降低退火溫度可能增加擴增產量，但引物與模板間的錯配現象也會增多，導致非特異性擴增上公升。
相反，提高退火溫度雖然可以提高反應的特異性，但會引起擴增效率下降，甚至無擴增產物出現。引物的退火溫度可以通過tm=4(g+c)+2(a+t)公式組略估算，一般在算出的tm值上減去5攝氏度極為較合適反應設計退火溫度。
剛到體系辦，我應該從何入手，怎麼工作？
人力資源最基礎的就是工作分析，招聘，薪酬，績效都是從工作分析出發的，任何乙個企業想要正規化都要從工作分析開始。由於是一家民營企業，規模不是特別巨大，崗位也應該不算很複雜，所以先做乙個工作分析應該還是很簡單的。工作分析包括工作描述就是他在這個崗位上幹什麼，還有就是任職資格，就是要具備什麼樣的要求才能幹...
我的手機連不上wifi，應該怎麼設定路由器
用一支牙籤，找到路由器的標有reset小孔，插一下，路由器回到出廠狀態 把寬頻的網線插在路由器的 wan介面上，電腦用網線連線到路由器的lan介面，對路由器做如下設定 1 登入到你的路由器 ie中輸入192.168.0.1或192.168.1.1登入，輸入使用者名稱和密碼，路由器標貼上有。通常是ad...
我的手機郵箱怎麼設定，vivo手機怎麼設定郵箱？
娛樂圈那點二三事 郵箱註冊 怎麼在vivo手機上註冊郵箱？看完你學會了嗎 求助，我用163郵箱，我的手機是iphone，怎麼設定imap。 按照乙個郵箱軟體就可以，具體設定 雪山 1.以抄iphone為例，進入iphone的設定，點選郵件 通訊錄 日曆 2.選擇郵箱型別 請選擇其他 3.輸入郵箱的位...