1樓：神無幸村
熔解溫度（tm）是引物的乙個重要引數。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈dna分子時的溫度.tm對於設定pcr退火溫度是必需的。
在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 tm低5℃。
設定tm有幾種公式。有的是**於高鹽溶液中的雜交，適用於小於18鹼基的引物。 有的是根據gc含量估算tm。
確定引物tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰鹼基的特性**引物的雜交穩定性。大部分電腦程式使用近鄰分析法。
根據所使用的公式及引物序列的不同，tm會差異很大。因為大部分公式提供乙個估算的tm值，所有退火溫度只是乙個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。
開始低於估算的tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。
為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的tm值。引物對的tm差異如果超過5℃，就會引物在迴圈中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物tm不同，將退火溫度設定為比最低的tm低5℃
或者為了提高特異性，可以在根據較高tm設計的退火溫度先進行5個迴圈，然後在根據較低tm設計的退火溫度進行剩餘的迴圈。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2樓：匿名使用者
我是採用primer5軟體推薦的tm值作為退火溫度的，基本都是可行的。如果pcr結果不好，可以上下浮動幾度進行梯度pcr進行退火溫度的優化。
3樓：小蠻
計算退火溫度的方法：
1. 退火溫度＝4×（g＋c）＋2×（a＋t）－（5～8） 只是粗算，有時不靈，但比較簡便。
2.用primer5（or oligo6）計算，引物配對好後，primer5可以顯示tm，我認為這個值就是退火溫度，我的經驗再加2 or 3度最好。
3.合成引物的單子上也有個tm，減去5～8也可，但有些公司提供的tm就是方法1計算的。
我認為方法二最準確，不知道還有其他方法嗎？
如何確定pcr反應中的退火溫度和延長時間
4樓：禾鳥
1、退火溫度低於引物tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的tm值（tm值=4(g+c) +2(a+t)）為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。
引物延伸一般在72℃進行（taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
擴充套件資料
pcr的過程：
1、dna變性：（90℃-96℃）：雙鏈dna模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈dna
2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與dna模板結合，形成區域性雙鏈。
3、延伸：（70℃-75℃）：在taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dntp為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的dna鏈。
5樓：匿名使用者
退火溫度一般是比你設計引物時的tm值低5度。不過這是要摸索的，用溫度梯度pcr。（順便說一下，如果你不想花時間摸索溫度，建議就用60度。
這個溫度是我原來做實驗時的萬能溫度。尤其對較短片段pcr適用）
延長時間是看pcr產物長度，一般認為常規taq酶一分鐘擴增1kb。比如你的pcr產物是500bp，你就用30秒。不過我一般會在這個基礎上再加5秒左右。
pcr退火溫度如何設定
6樓：匿名使用者
一般是引物tm值減去5度～但退火溫度不能太低～否則會造成非特異性結合～
我的PCR體系應該怎麼設定？退火溫度
根據你描述，體系可能性不大。所以給如下建議 1.檢查引物，確保正反向設計沒有問題，而且最後都是從5到3順序書寫並送交合成 這種錯誤很低階，但有人犯過，所以提醒，如果自己不很保證就讓別人把把關 2.再次要求生工合成引物 合錯可能性有，不大 或者重新換位置設計引物 2.由於是真菌，你用基因組還是cdna...
pcr擴增後沒有條帶是怎麼回事，PCR擴增後沒有條帶是怎麼回事
墨汁諾 pcr的反應條件與很多引數有關係。如模板濃度，引物長度及gc含量，引物濃度，dntps濃度，選用的taq enzyme,緩衝液的離子含量，產物大小，變性時間，退火溫度及時間，延長的時間。物理原因 變性對pcr擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性 退火溫度過低，可致非...
PCR引物怎麼合成，引物是怎麼合成的
這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些條件 1 足夠長,18 24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的primer同樣會降低特異性,並且降低產量 2 gc 40 60 3 5 端和中間序列要多gc,以增加穩定性 4 避免3 端g...