1樓：匿名使用者
細菌16s rrna基因序列是集高度保守和變異性與一身的，現在採用的多數pcr擴增引物都是採用的所有細菌的通用引物，即：幾乎能夠擴增出所有的真細菌。所以，16s rdna的擴增面臨的主要問題是汙染，只要有其他細菌dna的汙染，就可能出現假陽性或測序重疊峰，也就是說一條1500bp的帶可能是多個細菌的16s rdna的擴增產物的混合物。
解決這一問題需要注意的事項很多：
1.所有的物品和試劑都要嚴格防汙染，包括taq酶，有很多公司產的聚合酶是用細菌生產的，如果處理純化不當可能含有細菌的dna；
2.擴增模板開始時一定要選取單個菌落來製備；
3.由於該基因在多數細菌基因組內是多拷貝的，所以模板dna的量不宜太多，否則有非特異性擴增（你的帶看上去模板dna就有些過量）
4.測序宜採用連線t載體後進行，不宜採用pcr產物直接測序的方法。
5.每次pcr都要設立未加模板的空白對照！
6.**中引物二聚體也很多，需適當減少反應體系中引物的用量。
2樓：匿名使用者
估計細菌不是單一菌株吧？如果不是單一菌株，提高點退火溫度，擴出不彌散的條帶，割膠純化後做克隆，挑10至20個測序。如果是單一菌株就只提高退火溫度就好了。
3樓：風蕭蕭邊歌幾處
1、smear是非特異擴增的結果。割膠**回來就好。
2、測序出現非特異：說明你的原始菌體不單一，建議做個克隆後挑幾個斑測序。
pcr的產物跑瓊脂糖凝膠電泳時，所有樣都不出現條帶，而是彌散狀的，從投拖到尾
4樓：匿名使用者
“從頭拖到尾，另外一對引物就能做出來”
說明不是引物之間形成二聚體，而是第一對引物的設計有問題（特異性很差）。如果一定要擴增那個區，建議引物的位置向兩邊放一放。如果你沒有好的設計軟體，建議到primer3去試試（目前最好的免費引物設計）。
如果還是不行，把序列發給我，我幫你設計（我有專業軟體，abi primer express 3 和 invitrogen vector nti 10)
5樓：浙大阿米巴
看不懂廢話毛
說明你的引物不是一般的差。第一步是提高退火溫度試試，還是不行就只能按照一樓說的重新設計。
6樓：軒轅頑童
引物設計問題，引物特意性差，3‘端gc比太高，或者有引物落入了串聯重複序列中。建議做一下primer－blast看一下是什麼問題，然後重新設計
7樓：匿名使用者
可能就是引物特異性的問題，到網上再重新設計一個吧
什麼是pcr?
8樓：鬆恭載琬
pcr（polymerase
chain
reaction
）即聚合酶鏈式反應
pcr技術的基本原理：該技術是在模板dna、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴於dna聚合酶的酶促合成反應。dna聚合酶以單鏈dna為模板，藉助一小段雙鏈dna來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈dna模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。
在適宜的溫度和環境下，dna聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-oh末端，並以此為起始點，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的dna互補鏈。
pcr反應的基本成分包括：模板dna(待擴增dna)、引物、4種脫氧核苷酸(dntps)、dna聚合酶和適宜的緩衝液。類似於dna的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
pcr由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板dna的高溫變性：模板dna經加熱至93℃左右一定時間後，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板dna與引物的低溫退火(復性)：
模板dna經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合；③引物的適溫延伸：dna模板--引物結合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板dna
鏈互補的半保留複製鏈重複迴圈變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留複製鏈”，而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2～4分鐘，
2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
9樓：柚夏
pcr是聚合酶鏈式（polymerase chain reaction）反應的簡稱，是一種將幾個或幾十個拷貝數dn**段擴增至上百萬份拷貝的方法，這是迄今為止最為重要的技術之一。pcr技術的影響不僅僅侷限於生物科學領域，幾乎人人都可以感受到pcr所帶來的改變，在親子鑑定以及犯罪調查中pcr技術便有廣泛應用。
pcr可以被認為是與發生在細胞內的dna複製過程相似的技術，其結果都是以原來的dna為模板產生新的互補dn**段。細胞中dna的複製是一個非常複雜的過程。參與複製的有多種因素。
pcr是在試管中進行的dna複製反應，基本原理與細胞內dna複製相似，但反應體系相對較簡單。
pcr由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
①模板dna的變性：模板dna經加熱至94℃左右一定時間後，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；
②模板dna與引物的退火(復性)：模板dna經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：dna模板--引物結合物在taq酶的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板dna 鏈互補的半保留複製鏈。
重複迴圈變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留複製鏈”，而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
參考資料
pcr技術原理.丁香通[引用時間2018-5-11]
10樓：春玉英進婷
pcr是聚合酶鏈式反應。這個反應的發生需要目標dna，也需要聚合酶（要不怎麼叫聚合酶鏈式反應呢？）還有4種脫氧核苷酸a、g、c、t。
（注意，a、g、c、t是他們的鹼基，在一定情況下也能指代核糖核苷酸核苷酸或脫氧核苷酸。）
我估計能問這個問題的人不是個初學者就是個高深莫測的人……
11樓：自由之聲了
是手遊princess connect!re dive（公主連結r）的簡稱
12樓：匿名使用者
聚合酶鏈鎖反應，polymerase chain reaction，簡稱pcr，是一種分子生物學技術，用於放大特定的dn**段。可看作生物體外的特殊dna複製。
※pcr基本原理
pcr技術的基本原理類似於dna的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。pcr由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
①模板dna的變性：模板dna經加熱至93℃左右一定時間後，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；
②模板dna與引物的退火(復性)：模板dna經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：dna模板--引物結合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板dna 鏈互補的半保留複製鏈重複迴圈變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留複製鏈”，而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需 2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
到達平臺期所需迴圈次數取決於樣品中模板的拷貝。
※pcr反應特點
特異性強
pcr反應的特異性決定因素為：
①引物與模板dna特異正確的結合；
②鹼基配對原則；
③taq dna聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及taq dna聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。
再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。
靈敏度高
pcr產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10- 12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，pcr的靈敏度可達3個rfu(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
簡便、快速
pcr反應用耐高溫的taq dna聚合酶，一次性地將反應液加好後，即在dna擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性汙染、易推廣。
對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養細胞，dna 粗製品及rna均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛髮、細胞、活組織等dna擴增檢測。
13樓：麥兜櫻
pcr就是一種用來大量複製目的基因的生物技術
14樓：匿名使用者
pcr診斷技術又叫多聚酶鏈式反應技術，它採用分子技術模擬核酸在體內的複製，從而判定疾病病原的種類，所以從本質上來說，這是一種實驗室診斷方法。目前省內一些科研和檢測機構，如山東省農科院、山東農業大學以及山東省獸醫總站都已經熟練掌握了這項技術。
以往給動物治病，獸醫都是採用看聞問摸的方法，這就要等到動物表現出明顯的症狀，才能初步判定疾病的型別，有時病症複雜了，還得經過很長一段時間的**性診斷，不僅錯過了**的最佳時間，還會造成飼料和藥品的浪費。甚至還會出現誤診。而pcr技術就不同了，它不需要觀察動物的外觀表現，所以無論是在潛伏期還是爆發期，只要對動物的相應器官進行檢測，在兩個小時內就能準確判定出畜禽疾病的原因和種類，這就意味著能夠快速**爆發的疾病。
另外，這項技術也能作為確定某些疾病流行的權威依據。特別是目前其他各種技術都很難確診的病毒病，通過它就可以非常直觀的得出結論。
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