1樓：匿名使用者
退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響pcr特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。
由於模板dna 比引物複雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對於20個核苷酸，g+c含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。
引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： tm值(解鏈溫度)=4(g+c)＋2(a+t) 復性溫度=tm值-(5～10℃) 在tm值允許範圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高pcr反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。
2樓：網友
退火溫度基本和引物。
有關，如果產物特異性。
不好，可以適當提高退火溫度。
迴圈次數是你自己定的，如果模板量低（產物量少）就多迴圈幾圈，不過最好別超過35個，裡邊的成分都耗損的差不多了。再迴圈也沒大用了。
如何確定pcr反應中的退火溫度和延長時間
3樓：信必鑫服務平臺
1、退火溫度低於引物tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的tm值（tm值=4(g+c) +2(a+t)）為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。
引物延伸一般在72℃進行（taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
pcr退火溫度怎麼確定?
4樓：溫嶼
計算退火溫度的方法：
1.退火溫度＝4×（g＋c）＋2×（a＋t）－（5～8） 只是粗算，有時不靈，但比較簡便。
2.用primer5（or oligo6）計算，引物配對好後，primer5可以顯示tm,我認為這個值就是退火溫度，我的經驗再加2 or 3度最好。
3.合成引物的單子上也有個tm,減去5～8也可，但有些公司提供的tm就是方法1計算的。
我認為方法二最準確，不知道還有其他方法嗎？
pcr反應退火溫度的高低與什麼因素有關
5樓：惠企百科
退火溫度是影響pcr反應特異性的重要因素。
引物與模板復性所需要的退火溫度取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度。引物長度越短，引物中g+c的含量越低，所需的退火溫度越低。雖然降低退火溫度可能增加擴增產量，但引物與模板間的錯配現象也會增多，導致非特異性擴增上公升。
相反，提高退火溫度雖然可以提高反應的特異性，但會引起擴增效率下降，甚至無擴增產物出現。引物的退火溫度可以通過tm=4(g+c)+2(a+t)公式組略估算，一般在算出的tm值上減去5攝氏度極為較合適反應設計退火溫度。
如何確定pcr反應中的退火溫度和延長時間
6樓：網友
退火溫度一般是比你設計引物時的tm值低5度。不過這是要摸索的，用溫度梯度pcr。（順便說一下，如果你不想花時間摸索溫度，建議就用60度。
這個溫度是我原來做實驗時的萬能溫度。尤其對較短片段pcr適用）
延長時間是看pcr產物長度，一般認為常規taq酶一分鐘擴增1kb。比如你的pcr產物是500bp，你就用30秒。不過我一般會在這個基礎上再加5秒左右。
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