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10種常用的細菌檢測方法
一、[3h]脫氧胸苷攝入法測定細胞數：
1、用rpmi-1640培養液洗滌對數生長期（培養3天）的ctll-2細胞兩次，每次250×g離心10分鐘，洗去培養液中殘存的il-2。
2、用台盼藍（1% trypan blue）染色法計數細胞並決定細胞的活力，用10%小牛血清的rpmi-1640培養液懸浮細胞至1×105/ml。
3、在96孔細胞培養板中每孔加0.1ml倍比稀釋的標準il-2或待測樣品，每個稀釋度三個復孔，標準il-2從40 iu/ml稀釋到0.019 iu/ml（8～10個稀釋度），陰性對照孔不加il-2。
4、每孔加0.1ml細胞懸液，在37℃ 5% co2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養18～24小時。每孔加10μl（0.
5μci或1.85×104bq）[3h]脫氧胸苷，繼續培養4小時。
5、用多頭細胞收集器將細胞收集到玻璃纖維濾紙上，用3%醋酸水溶液濾紙3次，洗去游離的[3h]tdr。將濾紙置液體閃爍瓶中，加入5ml閃爍液。在液體閃爍儀上計數細胞攝入的同位素活性（每分鐘放射性計數，cpm），根據儀器效率換算成dpm（每分鐘衰變量）。
6、用dpm值對樣品稀釋倍數作圖。在圖上，標準il-2的曲線與待測樣品的曲線應當呈平行的s型，說明是同樣的分子反應。比較同樣dpm處的不同稀釋倍數，決定待測樣品的相應濃度。
二、mtt檢測法：
1、取96孔細胞培養板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶細胞的培養液（含10%小牛血清的rpmi-1640培養液），在37℃ 5% co2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養2～3小時讓細胞帖壁（如果是懸浮細胞可直接進行下一步）
2、用rpmi-1640培養液2～10倍遞次稀釋細胞因子標準品，根據情況2～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標準品和待檢樣品，每個稀釋度3個重複孔。對照孔6個：
3個陽性對照孔，每孔加0.1ml含大劑量細胞因子的rpmi-1640培養液，3個陰性對照孔，每孔加0.1ml rpmi-1640培養液。
在37℃ 5% co2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養24～48小時或預定的時間。
3、吸去培養液，用pbs洗滌一次（如為懸浮細胞，應在吸去上清液前離心培養板）。
4、每孔加0.1ml pbs和10μl mtt染液，在37℃ 5% co2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養4～6小時。
5、每孔加0.1ml酸化異丙醇，也可用含10% sds的10mmol/l hcl代替酸化異丙醇，在振盪器上振盪混勻，讓還原產物充分溶解。置酶聯檢測儀上測定光密度（od）值，檢測波長570nm，參考波長630nm。
以od值對樣品稀釋度作圖，比較標準曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。
三、xtt檢測法：
用xtt代替mtt可省去溶解還原產物結晶的步驟，xtt可以被活細胞中的代謝酶還原成黃色水溶性的代謝產物（formazan）。代謝產物在od450處有吸收峰。
四、mts檢測法：
1、培養il-2依賴細胞株ctll-2細胞或ht-2細胞（檢測il-2），或者il-3依賴細胞株fdc-p1細胞或fl5.12細胞（檢測il-3）到對數生長期。
2、取96孔細胞培養板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述細胞之一的dmem培養液（加10%小牛血清）。
3、每孔加0.1ml系列稀釋的待測細胞因子（il-2或il-3）樣品或細胞因子標準品，在37℃ 5% co2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養24小時。
4、每孔加20μl mts/pms混合液，繼續培養3～4小時顯色。
5、檢測前搖晃培養板10秒鐘，混勻顏色。在酶聯檢測儀上，波長570nm（或490nm，或570nm和690nm）處檢測各孔的光吸收值（od）。用樣品稀釋度對od值（od570、od490或od570/od690）繪製劑量-反應曲線，根據標準品曲線計算樣品中細胞因子的量。
五、nag檢測法：
1、按mtt檢測法培養細胞和用不同稀釋度的細胞因子處理細胞。
2、吸去培養液，用pbs洗滌兩次（如為懸浮細胞，應在吸去上清液前先離心）。
3、每孔加60μl nag染液，在37℃ 5% co2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養4小時。
4、每孔加90μl終止液，混勻後置酶聯檢測儀上測定光密度（od）值，檢測波長402nm。以od值對樣品稀釋度作圖，比較標準曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。
六、alamarbluetm攝入法：
1、按mtt檢測法培養細胞和用不同稀釋度的細胞因子處理細胞。
2、在培養結束前24小時加入alamar blue染料，96孔細胞培養板每孔20μl。
3、在培養結束後，直接在酶聯檢測儀上測定光吸收值。氧化型alamar blue的最大光吸收在570nm，用od570減去od600即為活細胞還原的alamar blue染料，顏色深淺與活細胞數成正比。
七、鹼性磷酸酶檢測法（akp法）：
1、按mtt法用細胞因子處理靶細胞適當時間，用pbs洗去死亡細胞，洗兩次。
2、向96孔細胞培養板各孔中加0.2ml新鮮配製的底物液（0.2mol/l 硼酸，1mmol/l mgcl2，1.
2mmol/l甲傘基磷酸）。在37℃ 5% co2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養3小時。
3、在螢光計數儀上測定螢光的量。根據測定已知不同數目細胞的螢光量作出標準曲線，根據標準曲線可得到各孔中的活細胞數。
八、三磷酸腺苷檢測法（atp法）：
1、atp反應液（bio-orbit）是粉末狀混合物，含有螢光素、螢光素酶、0.5mmol醋酸鎂、50mg bsa和0.1μmol無機焦磷酸。
在4℃可以儲存1個月。用前用10ml含2mmol/l edta的0.1mol/l ph7.
75 tris-醋酸緩衝液稀釋。稀釋液分裝後可在－20℃長期儲存。
2、在已經完成促增殖或抑生長試驗後的96孔細胞培養板中（每孔含100μl細胞培養液），每孔加0.1ml atp釋放因子，室溫中反應5分鐘。取另一塊96孔細胞培養板，從第一塊板的各孔中吸0.
1ml細胞溶解物到第二塊板的相應各孔。
3、在低於25℃中，將第二塊板置自動多孔螢光檢測儀中。用自動加樣器，每孔加入20μl atp反應液，立即檢測10秒鐘的螢光強度。溫度公升高，檢測敏感性就下降。
4、用rlu（y軸）對細胞因子標準品的稀釋度（x軸）作標準曲線，根據標準曲線確定待測樣品中細胞因子的含量。
九、染料染色法測定細胞數：
1）結晶紫檢測法：
1、在96孔細胞培養板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 wehi-164細胞的培養液（含10%小牛血清的rpmi-1640培養液），37℃ 5% co2的二氧化碳培養箱中培養2～3小時，讓細胞帖壁。
2、用rpmi-1640培養液10倍遞次稀釋tnf標準品，根據需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標準品或待檢樣品，每個稀釋度3個重複孔。對照孔6個，3個陽性對照孔各加0.
1ml含4μg tnf的rpmi-1640培養液，3個陰性對照孔各加100μl rpmi-1640培養液。繼續培養18～24小時。
3、甩去培養液，用pbs小心洗滌一次，每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定細胞30秒鐘。
4、吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml結晶紫染液，室溫中放置20分鐘。
5、輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養板倒置於吸水紙上吸乾水分。自然乾燥或37℃烘乾。此板可以在室溫中長期儲存。
6、測定前，每孔加0.1ml 33%醋酸脫色，充分振盪後在570nm處測定光吸收度。用光吸收度（od）值對樣品稀釋度作圖，比較標準品曲線和待檢樣品曲線即可得到待測樣品中的細胞因子活性
2）nbb檢測法：
1、在用細胞因子處理靶細胞以後傾去培養液，倒置培養板於吸水紙上吸乾培養液。再用100μl磷酸緩衝鹽水小心洗去死細胞，用吸水紙吸乾培養液。
2、每孔加100μl nbb染液，室溫中染色30分鐘。輕輕染液。用吸水紙吸乾染液。
3、每孔加100μl****固定液固定15分鐘。用自來水輕輕洗去固定液，倒置培養板，用吸水紙吸乾染液。
4、每孔加150μl 50mmol/l氫氧化鈉。輕輕振盪培養板直到染料全部溶解並均勻分布。在分光光度計上讀取各孔在620nm處的光密度（od）值。計算tnf的活性。
3）美藍染色檢測法：
1、用細胞因子處理靶細胞，在含100μl細胞培養液的檢測孔中，每孔加0.02ml 25%戊二醛固定活細胞15分鐘，用自來水緩緩洗去死細胞和固定液。
2、每孔加0.1ml 0.05%美藍染液，染色20分鐘，用自來水緩緩沖淨染液，晾乾。
3、每孔加0.2ml 0.33mol/l鹽酸溶解美藍，振盪混勻。在665nm波長處測定光吸收度。計算tnf的活性。
4）中性紅染色檢測法：
1、用細胞因子處理靶細胞，在含100μl細胞培養液的檢測孔中，每孔加50μl 5%中性紅染液。繼續培養2小時。
2、小心倒去培養液。用200μl hanks液洗滌細胞1次。小心倒去培養液，減少細胞丟失。
3、每孔加100μl脫色液，在搖床中輕輕搖晃溶解30分鐘。在550nm波長處測定od值。
十、直接計數細胞：
1、如果靶細胞是帖壁細胞，在細胞因子作用適當時間後，用生理鹽水洗去死亡細胞，用0.25%胰蛋白酶液消化細胞。加適量生理鹽水吹打，使細胞分散成單個細胞。
直接在血細胞計數板上計數細胞。
2、如果靶細胞是懸浮細胞，則需要用染色劑區分死細胞和活細胞然後再計數。通常用台盼藍染色細胞，活細胞可以排除進入細胞的臺盼藍而不著染，死細胞著染呈深藍色。
3、計數血細胞計數板上4個大方格中的全部活細胞，按下式計算活細胞數：活細胞數（個/ml）＝計數的全部活細胞數×10 000×2×1/4。
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