1樓：匿名使用者
dna序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今 dna序列分析的主流。美國pe abi公司已生產出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。
原理：abi prism 310型基因分析儀(即dna測序儀)，採用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯醯胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddntp(標記終止物法)，因此通過單引物pcr測序反應，生成的pcr產物則是相差1個鹼基的3''''末端為4種不同熒光染料的單鏈dna混合物，使得四種熒光染料的測序 pcr產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由於分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數視窗段時，鐳射檢測器視窗中的ccd(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同鹼基資訊的不同顏色的熒光，並在ccd攝影機上同步成像，分析軟體可自動將不同熒光轉變為dna序列，從而達到dna測序的目的。
分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或鹼基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動資料收集分析等全自動電腦控制的測定dn**段的鹼基順序或大小和定量的高檔精密儀器。pe公司還提供凝膠高分子聚合物，包括dna測序膠(pop 6)和genescan膠(pop 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。
它主要由毛細管電泳裝置、macintosh電腦、彩色印表機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器執行等軟體。它使用最新的ccd攝影機檢測器，使dna測序縮短至2.
5h，pcr片段大小分析和定量分析為 10～40min。
由於該儀器具有dna測序，pcr片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行dna測序、雜合子分析、單鏈構象多型性分析(sscp)、微衛星序列分析、長片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析，臨床上可除進行常規dna測序外，還可進行單核苷酸多型性(snp)分析、基因突變檢測、hla配型、法醫學上的親子和個體鑑定、微生物與病毒的分型與鑑定等。
2樓：雙槍老椰子
dna序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今dna序列分析的主流。美國pe abi公司已生產出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。
abi prism 310型基因分析儀(即dna測序儀)，採用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯醯胺平板電泳，應用該公司利的四色熒光染料標記的ddntp(標記終止物法)，因此通過單引物pcr測序反應，dna測序儀生成的pcr產物則是相差1個鹼基的3''''末端為4種不同熒光染料的單鏈dna混合物，使得四種熒光染料的測序 pcr產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由於分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數視窗段時，鐳射檢測器視窗中的ccd(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同鹼基資訊的不同顏色的熒光，並在ccd攝影機上同步成像，分析軟體可自動將不同熒光轉變為dna序列，從而達到dna測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或鹼基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動資料收集分析等全自動電腦控制的測定dn**段的鹼基順序或大小和定量的高檔精密儀器。pe公司還提供凝膠高分子聚合物，包括dna測序膠(pop 6)和genescan膠(pop 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。
它主要由毛細管電泳裝置、macintosh電腦、彩色印表機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器執行等軟體。它使用最新的ccd攝影機檢測器，使dna測序縮短至2.
5h，pcr片段大小分析和定量分析為 10～40min。
由於該儀器具有dna測序，pcr片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行dna測序、雜合子分析、單鏈構象多型性分析(sscp)、微衛星序列分析、長片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析，臨床上可除進行常規dna測序外，還可進行單核苷酸多型性(snp)分析、基因突變檢測、hla配型、法醫學上的親子和個體鑑定、微生物與病毒的分型與鑑定等。
3樓：當紅黑成為習慣
這是我在網上找來的，自己感覺說的挺全的，你看看。
不過我要說一句，目前dna測序所依靠的還是sanger的原理，只是結合了熒光染料，提高了靈敏度。
dna測序原理和方法
dna序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今 dna序列分析的主流。美國pe abi公司已生產出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。
本實驗介紹的是abi prism 310型dna測序儀的測序原理和操作規程。
【原理】 abi prism 310型基因分析儀(即dna測序儀)，採用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯醯胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddntp(標記終止物法)，因此通過單引物pcr測序反應，生成的pcr產物則是相差1個鹼基的3''''末端為4種不同熒光染料的單鏈dna混合物，使得四種熒光染料的測序 pcr產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由於分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數視窗段時，鐳射檢測器視窗中的ccd(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同鹼基資訊的不同顏色的熒光，並在ccd攝影機上同步成像，分析軟體可自動將不同熒光轉變為dna序列，從而達到dna測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或鹼基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動資料收集分析等全自動電腦控制的測定dn**段的鹼基順序或大小和定量的高檔精密儀器。pe公司還提供凝膠高分子聚合物，包括dna測序膠(pop 6)和genescan膠(pop 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。
它主要由毛細管電泳裝置、macintosh電腦、彩色印表機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器執行等軟體。它使用最新的ccd攝影機檢測器，使dna測序縮短至2.
5h，pcr片段大小分析和定量分析為 10～40min。
由於該儀器具有dna測序，pcr片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行dna測序、雜合子分析、單鏈構象多型性分析(sscp)、微衛星序列分析、長片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析，臨床上可除進行常規dna測序外，還可進行單核苷酸多型性(snp)分析、基因突變檢測、hla配型、法醫學上的親子和個體鑑定、微生物與病毒的分型與鑑定等。
【試劑與器材】
1．bigdye測序反應試劑盒 主要試劑是bigdye mix，內含pe專利四色熒游標記的ddntp和普通dntp，amplitaq dna polymerase fs，反應緩衝液等。
2．pgem-3zf (+) 雙鏈dna對照模板 0.2g/l，試劑盒配套試劑。
3．m13(-21)引物 tgtaaaacgacggccagt，3.2μmol/l，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。
4．dna測序模板 可以是pcr產物、單鏈dna和質粒dna等。模板濃度應調整在pcr反應時取量1μl為宜。本實驗測定的質粒dna，濃度為0.2g/l，即200ng/μl。
5．引物 需根據所要測定的dn**段設計正向或反向引物，配製成3.2μmol/l，即3.2pmol/μl。
如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如m13(-21)引物，t7引物等。
6．滅菌去離子水或三蒸水。
7．0.2ml或和0.5ml的pcr管 蓋體分離，pe公司產品。
8．3mol/l 醋酸鈉(ph5.2) 稱取40.8g naac·3h2o溶於70ml蒸餾水中，冰醋酸調ph至5.2，定容至100ml，高壓滅菌後分裝。
9．70%乙醇和無水乙醇。
10．naac/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/l naac混勻，室溫可儲存1年。
11．pop 6測序膠 abi產品。
12．模板抑制試劑(tsr) abi產品。
13．10×電泳緩衝液 abi產品。
14．abi prism 310型全自動dna測序儀。
15．2400型或9600型pcr儀。
16．臺式冷凍高速離心機。
17．臺式高速離心機或袖珍離心機。
【操作步驟】
1．pcr測序反應
(1) 取0.2ml的pcr管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測定模板管 標準對照管
bigdye mix 1μl 1μl
待測的質粒dna 1μl －
pgem-3zf (+) 雙鏈dna － 1μl
待測dna的正向引物 1μl －
m13(-21)引物 － 1μl
滅菌去離子水 2μl 2μl
總反應體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊pcr管，用手指彈管混勻，稍離心。
(2) 將pcr管置於9600或2400型pcr儀上進行擴增。98℃變性2min後進行pcr迴圈，pcr迴圈引數為96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25個迴圈，擴增結束後設定4℃保溫。
2．醋酸鈉/乙醇法純化pcr產物
(1) 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5ml ep管中。
(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振盪，置冰上10min以沉澱dna。12 000r/min於4℃離心30 min，小心棄上清。
(3) 加70%(v/v)的乙醇50μl洗滌沉澱2次。12 000r/min於4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空乾燥沉澱10～15min。
3．電泳前測序pcr產物的處理。
(1) 加入12μl的tsr於離心管中，劇烈振盪，讓其充分溶解dna沉澱，稍離心。
(2) 將溶液轉移至蓋體分離的0.2ml pcr管中，稍離心。
(3) 在pcr儀上進行熱變性(95℃ 2min)，冰中驟冷，待上機。
4．上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立執行的測序順序檔案。儀器將自動灌膠至毛細管，1.2kv預電泳5min，按程式設計次序自動進樣，再預電泳(1.
2kv，20min)，在7.5kv下電泳2h。電泳結束後儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。
每一個樣品電泳總時間為2.5h。電泳結束後儀器會自動分析或列印出彩色測序圖譜。
5．儀器將自動進行序列分析，並可根據使用者要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異鹼基處，提高工作效率。
6．測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。
【計算】
測序反應精確度計算公式：100%－差異鹼基數(不包括n數)/650×100%
差異鹼基即測定的dna序列與已知標準dna序列比較不同的鹼基，n為儀器不能辨讀的鹼基。
【注意事項與評價】
1．abi prism 310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護。
2．本實驗測序pcr反應的總體積是5μl，而且未加礦物油覆蓋，所以pcr管蓋的密封性很重要，除加完試劑後蓋緊pcr管蓋外，最好選用pe公司的pcr管。如pcr結束後pcr液小於4～4.5μl，則此pcr反應可能失敗，不必進行純化和上樣。
3．作為測序使用者來說，只需提供純化好的dna樣品和引物，一個測序pcr反應使用的模板不同，需要的dna量也就不同，pcr測序所需模板的量較少，一般pcr產物需30～90ng，單鏈dna需50～100ng，雙鏈dna需200～500ng，dna的純度一般是a260nm/a280nm為 1.6～2.0，最好用去離子水或三蒸水溶解dna，不用te緩衝液溶解。
引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。
4．本實驗使用的測序試劑盒是bigdye熒游標記終止底物迴圈測序試劑盒，一般可測dna長度為650bp左右。本儀器dna測序精確度為 (98.5±0.
5) %，儀器不能辨讀的鹼基n＜2%，所需測定的長度超過了650bp，則需設計另外的引物。為保證測序更為準確，可設計反向引物對同一模板進行測序，相互印證。對於n鹼基可進行人工核對，有時可以辨讀出來。
為提高測序的精確度，根據星號提示位置，可人工分析該處彩色圖譜，對該處鹼基作進一步核對。
為什麼DNA測序需要剪成小段呢，為什麼DNA測序需要剪成小段呢是因為只能
派森諾生物 如果您指的是dna二代測序建庫時需要打斷成特定長度的片段的話，是因為不同儀器的測序讀長是不一樣的，因此在建庫過程中所需要的插入片段長度也有一定的限制，比如對於illumina平臺來說，dna插入片段的長度一般在400 500bp左右，如需測通的話，這個片段長度要進一步剪短至讀長範圍內 如...
做全基因組測序前，需要檢測dna濃度和純度嗎
巨集基因組是指特定環境中全部生物 微生物 遺傳物質的總和。巨集基因組測序是利用高通量測序技術對環境樣品中全部微生物的基因組進行測定，以獲得單個樣品的飽和資料量，可進行微生物群體的基因組成及功能注釋，微生物群體的物種分類，多樣性分析，群落結構分析，樣品間的物種或基因差異以及物種間的代謝網路研究，探索微...
RNA測序究竟有多可靠，RNA是測序深度為什麼
你要看是什麼rna 普通轉錄組mrna技術還是很成熟的 基本沒什麼問題 其他特殊一些的比如microrna circlerna lncrna等可靠性會低一些 rna是測序深度為什麼 砂粒 rna測序 bai深度,當reads 50bp，single end 數目du從2.5m增加zhi到10m時，r...