1樓：科普小星球
以雙鏈dna測序為例，雙脫氧末端終止法的基本步驟包括：變性雙鏈模板的製備和延伸和終止反應。
1、變性雙鏈模板的製備
① 取1.5ml處於對數生產期的培養菌液（含有待測病毒核酸的重組質粒模板），離心除去上清液後，用150ml tris/葡萄糖緩衝液重懸菌團，在室溫下放置5分鐘。
② 加入300ml的1%sds，0.2mol/l naoh，顛倒混合約15次，在室溫下放置15分鐘，加入225ml 3mol/l醋酸鈉（ph4.5），顛倒約15次混合，在冰浴中放置45分鐘，離心5分鐘。
③ 將650ml上清液轉移至一支新管中，加入650ml異丙醇，混合後在室溫下放置10分鐘，離心5分鐘後棄去異丙醇，抽真空乾燥沉澱。
④ 用125ml te(ph 8.0）重新溶解dna，加入375ml的4mol/l licl，在冰浴中放置20分鐘後，於4℃下離心5分鐘。
⑤ 將上清液轉移至一支新管中用飽和苯酚抽提後再用氯仿抽提，加入2倍體積的異丙醇，在室溫下沉澱30分鐘，離心5分鐘，棄去上清液。
⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉澱，離心5分鐘，棄去上清液並乾燥，用50ml te緩衝液重新溶解沉澱。用紫外分光光度計測定質粒dna含量。
⑦ 取0.2mg質粒dna，並將體積調至9ml，加入1ml 2mol/l naoh，2mmol/l edta，在室溫下放置5分鐘，加入2ml 30mol/l醋酸鈉（ph 4.5）和8ml水。
⑧ 加入6ml冰冷無水乙醇，混合後在乾冰/乙醇浴中放置15分鐘，在4℃下離心5分鐘，小心地棄去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉澱，離心5分鐘並小心地棄去上清液，真空抽乾沉澱，並用te緩衝液重新溶解沉澱。
2、延伸和終止反應
以利用t7dna聚合酶進行的雙脫氧鏈終止反應為例。
① 取4支0.5ml小離心管，標上g、a、t、c，每管加入7ml變性的雙鏈dna模板（分別為1和2mg），1ml寡核苷酸引物和2ml 5×測序緩衝液混合，65℃保溫2分鐘，在室溫下冷卻30分鐘。
② 每管加入1ml 0.1mol/l dtt，2ml 1.5mol/l 3種dntp混合物，0.
5ml32p datp和2ml（2iu）修飾的t7dna多聚酶混合物，在室溫下放置5分鐘。
③ 按標記每管分別加入3ml 4種ddntp終止混合物的一種。
④ 短促離心後，在37℃下保溫5分鐘。
⑤ 加入5ml甲醯胺上樣緩衝液，上樣前在80℃下加熱2分鐘，並迅速置於冰浴上，每個樣品取3ml，上樣電泳。
⑥讀取合成鏈的核苷酸序列。
擴充套件資料
延伸和終止反應中測序反應物電泳和序列讀取的注意事項：
（1） 按普通聚丙烯醯胺凝膠製作方法製作梯度膠。
（2） 按g、a、t、c次序加入每種樣品，在g、a和t各泳道上樣1ml，而在c泳道上樣1.5ml。
（3） 上樣完畢加壓1700v電泳，根據樣品中溴酚藍和二甲苯青染料遷移情況確定電泳時間。
（4） 電泳完畢，在10℃冰醋酸中漂洗30分鐘脫去尿素。
（5） 在60℃或80℃乾燥30分鐘後，放射自顯影讀取序列。
2樓：楊風遊
雙脫氧末端終止法
在模板指導下，聚合酶不斷將dntp加到引物的3』-oh末端，使引物延長，合成出新的互補的dna鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddntp）,由於雙脫氧核醣的3』位置上缺少乙個羥基，故不能同後續的dntp形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5』-引物端和以ddnmp殘基為3』端結尾的一系列長短不一片段的混合物。採用聚丙烯醯胺凝膠電泳區分長度差乙個核苷酸的單鏈dna，從而讀取dna的核苷酸序列。
雙脫氧鏈終止法 是現在應用最多的核酸測序技術，由sanger等2023年提出。
其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧鹼基存在條件下複製或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧鹼基，只要雙脫氧鹼基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧鹼基的片段可繼續延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5』端，以雙脫氧鹼基為3』端的一系列長度不等的核酸片段。
反應終止後，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差乙個鹼基)，根據片段3』端的雙脫氧鹼基，便可依次閱讀合成片段的鹼基排列順序。
(一) sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)測序程式 操作程式是按dna複製和rna反轉錄的原理設計的。
1.分離待測核酸模板，模板可以是dna，也可以是rna，可以是雙鏈，也可以是單鏈。
2.在4只試管中加入適當的引物、模板、4種dntp(包括放射性標記datp，例如?32 pdatp和dna聚合酶（如以rna為模板，則用反轉錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddntp(雙脫氧核苷酸)。
3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理)結合的引物，在dna聚合酶作用下從5』端向3』端進行延伸反應，32p隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddntp摻入時，由於它在3』位置沒有羥基，故不與下乙個dntp結合，從而使鏈延伸終止。
ddntp在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的dna鏈。
4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4只反應管中的反應產物，由於每一反應管中只加一種ddntp(如ddatp)，則該管中各種長度的dna都終止於該種鹼基(如a)處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的dna 3』 末端都為同一種雙脫氧鹼基。
5.放射自顯影。根據四泳道的編號和 每個泳道中dna帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。
雙脫氧鏈終止法的sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測序程式
3樓：匿名使用者
（一） sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測序程式 操作程式是按dna複製和rna反轉錄的原理設計的。
1.分離待測核酸模板，模板可以是dna，也可以是rna，可以是雙鏈，也可以是單鏈。
2.在4只試管中加入適當的引物、模板、4種dntp（包括放射性標記的ddntp，例如32p ddntp和dna聚合酶（如以rna為模板，則用反轉錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddntp（雙脫氧核苷酸）。
3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理）結合的引物，在dna聚合酶作用下從5』端向3』端進行延伸反應，32p隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddntp摻入時，由於它在3』位置沒有羥基，故不與下乙個dntp結合，從而使鏈延伸終止。
ddntp在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的dna鏈。
4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4只反應管中的反應產物，由於每一反應管中只加一種ddntp（如ddatp），則該管中各種長度的dna都終止於該種鹼基（如a）處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的dna 3』 末端都為同一種雙脫氧鹼基。
5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中dna帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。
雙脫氧法dna測序的基本原理是什麼
4樓：下限醬
dna測序技術，即測定dna序列的技術。在分子生物學研究中，dna的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於測序的技術主要有sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和 maxam和 gilbert（1977）發明的化學降解法。
這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某乙個特定的鹼基處終止，產生 a，t，c，g四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的page膠上電泳進行檢測，從而獲得dna序列。目前 sanger測序法得到了廣泛的應用。
sanger 法測序的原理就是利用一種dna聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dntp)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddntp)。
由於ddntp缺乏延伸所需要的3-oh基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在g、a、t或c處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dntps和ddntps的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千鹼基的鏈終止產物。
它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用x- 光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
5樓：淡定的思考做事
將四條一樣dna放到四個相同的試管，四（1，2，3，4）個試管原料的組成為：datp、dgtp、dctp、dttp、ddatp；datp、dgtp、dctp、dttp、ddgtp；datp、dgtp、dctp、dttp、ddctp；datp、dgtp、dctp、dttp、ddttp。這樣在1，2，3，4試管中遇到a，g，c,t鹼基就會有繼續或停下兩種可能，所以產生不同的片段。
然後再電泳，根據各個片段的長短，讀出序列。
6樓：紅色の狐狸喵
sanger法測序是酶法測序
雙脫氧鏈終止法的原理
7樓：鬱悶的太陽
雙脫氧鏈終止法是現在應用最多的核酸測序技術（也即第一代dna測序技術），由sanger等2023年發明提出。主要用於dna基因分析。其原理是：
核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧鹼基存在條件下複製或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧鹼基，只要雙脫氧鹼基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧鹼基的片段可繼續延長。
如此每管反應體系中便合成以共同引物為5』端，以雙脫氧鹼基為3』端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止後，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差乙個鹼基），根據片段3』端的雙脫氧鹼基，便可依次閱讀合成片段的鹼基排列順序。
sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測序程式 操作程式是按dna複製和rna反轉錄的原理設計的。
1.分離待測核酸模板，模板可以是dna，也可以是rna，可以是雙鏈，也可以是單鏈。
2.在4只試管中加入適當的引物、模板、4種dntp（包括放射性標記的ddntp，例如32p ddntp和dna聚合酶（如以rna為模板，則用反轉錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddntp（雙脫氧核苷酸）。
3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理）結合的引物，在dna聚合酶作用下從5』端向3』端進行延伸反應，32p隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddntp摻入時，由於它在3』位置沒有羥基，故不與下乙個dntp結合，從而使鏈延伸終止。
ddntp在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的dna鏈。
4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4只反應管中的反應產物，由於每一反應管中只加一種ddntp（如ddatp），則該管中各種長度的dna都終止於該種鹼基（如a）處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的dna 3』 末端都為同一種雙脫氧鹼基。
5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中dna帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。
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